茯磚茶中氯氰菊酯降解“金花菌”的降解特性及途徑*

鄧維琴，李金永，劉書亮，姚開，李建龍，胡凱弟，張夢梅，周康，韓新鋒

1(四川農業大學食品學院四川 雅安，625014)2(四川大學輕紡與食品學院，四川 成都，610065)

氯氰菊酯(cypermethrin，CY)等擬除蟲菊酯類農藥是農業中使用較廣的殺蟲劑，在控制危害棉花、水果、蔬菜等的害蟲方面發揮著至關重要的作用，已成為一種主要的殺蟲劑，逐漸替代了對人體毒害較大的有機磷等殺蟲劑［1］。盡管擬除蟲菊酯類農藥被認為是一類較為安全的殺蟲劑，但是近年來擬除蟲菊酯類農藥的殘留引起了越來越多的環境問題和人類的健康問題［2－3］。已有研究顯示，擬除蟲菊酯類農藥可能造成神經毒性［4］、生殖毒性［5－7］、內分泌干擾毒性［8］、免疫毒性［9］或基因毒性［10］等。另外，擬除蟲菊酯已被研究認為是一種致癌物質［11］。因此，減少或消除環境和農產品中擬除蟲菊酯農藥殘留已成為目前的研究熱點。

生物降解是一種安全有效的方法［12－13］。目前篩選出能有效降解氯氰菊酯的菌株主要有金色鏈霉菌(Streptomycesaureus)［14－15］、微 球 菌 (Micrococcus sp.)［13］、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)［16］、黑曲霉(Aspergillus niger)［17］、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)［18］等，這些菌株大多來源于農藥廠污水或被污染的土壤，相關研究大多為菌株的篩選及降解氯氰菊酯的特性方面。針對菌株降解氯氰菊酯途徑的研究較少，許育新等［19］研究發現CY的降解產物3-苯氧基苯甲酸(3-phenoxybenzoic acid，3-PBA)和 DCVA;CHEN等［14］通過氣相-質譜聯用儀(GC-MS)分析得出3-PBA和3-苯氧基苯甲醛是CY降解的中間產物;僅Tallur等［13］通過薄層層析法、紅外光譜及質譜鑒定了微球菌Micrococcus sp.CPN1降解CY的中間代謝產物，并檢測了各反應所需的酶活性，推測了該菌株降解CY的途徑，即通過水解羧酸酯鍵將氯氰菊酯分解為DCVA和氰基-3-苯氧基苯甲醇，氰基-3-苯氧基苯甲醇進一步轉化為3-PBA，3-PBA二苯醚鍵斷裂后分解為原兒茶酸和苯酚。

目前關于有益真菌降解CY的研究尚鮮見報道，僅見王志龍［17］報道了源于磚茶的黑曲霉YAT可有效降解CY。本研究將課題組從茯磚茶中篩選的1株可有效降解 3-PBA 的“金花菌”［20］——冠突散囊菌(Eurotium cristatum)ET1［21］作用于 CY，發現其對 CY也具有較強的降解能力。因此，本文研究了菌株ET1對CY的降解特性及途徑，為降低或消除環境和農產品中殘留CY提供了良好菌源和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

冠突散囊菌(Eurotium cristatum)ET1，四川農業大學食品微生物室保藏。

1.1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖培養基(PD)、基礎鹽培養基(MM)［17］;PDA:PD培養基中加入2%的瓊脂;含CY的PD培養基(PD-CY):在PD中加入0.2%的Tween 80，121℃滅菌15 min后在無菌條件下加入CY至所需濃度。

1.1.3 試劑

氯氰菊酯標準品(99.7%，國家標準物質中心);3-苯氧基苯甲酸(98%，美國Sigma公司);3-苯氧基苯甲醛(97%，美國Sigma公司);苯酚(99%，國家標準物質中心);檢測用乙腈(色譜純99.99%，德國CNW Technologies GmbH);提取用乙腈(分析純，上海星可生化有限公司)。

1.1.4 主要儀器

LC-10A2010C HT型液相色譜儀(包括可變波長紫外檢測器(UV)LC-solution1.1色譜工作站)，日本島津公司;GC-MS(Agilent-7890A-5975C)，美國 Agilent公司;RE-52AA型旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 冠突散囊菌ET1生長及降解曲線的測定

在無菌條件下將篩選的冠突散囊菌ET1劃線于PDA斜面，30℃培養84 h，無菌生理鹽水洗下菌苔混勻制成種子液(孢子濃度約為8.0×108CFU/mL)。

將冠突散囊菌ET1種子液按5%體積比的接種量分別接種于PD和PD-CY液體培養基(CY質量濃度50 mg/L)中，分裝30 mL/瓶，以接種等量的無菌生理鹽水作空白對照，于30℃、180 r/min振蕩培養，分別在 0、1、2、3、4、5、6、7、8 d 取整瓶培養液，測定冠突散囊菌ET1生物量及CY殘留質量濃度，供試菌生物量(g/L)以干重計，即將培養液過濾后取菌絲體于80℃干燥至恒質量，記錄質量。

CY的提取與測定方法如下:

培養后取整瓶培養液，加入等體積乙腈，超聲(40 kHz、300 W，30 min)輔助提取培養液中 CY，取2.0 mL提取液用乙腈定容至10 mL，混勻，12 000 r/min離心10 min，上清液用0.45 μm有機相濾膜過濾，棄去初濾液，HPLC檢測續濾液中CY殘留質量濃度［22－23］。

色譜條件:色譜柱為Sepax GP-C18柱(150 mm×4.60 mm，5.0 μm);流動相為乙腈和超純水(83∶17，V/V);檢測波長210 nm;柱溫25℃;流速1.0 mL/

式中:c0，空白對照中CY總質量濃度，mg/L;c，樣品培養液中CY殘留質量濃度，mg/L。

1.2.2 冠突散囊菌ET1對CY降解動力學特性的分析

1.2.2.1 底物濃度對冠突散囊菌ET1降解CY速率的影響

將菌株ET1種子液按體積比5%接種量接種至初始CY質量濃度分別為20、50、100 mg/L的PD培養基中(pH 6.0)，30℃，180 r/min振蕩培養，分別在0、1、2、3、4、5、6、7、8 d 取樣測定 CY 的殘留質量濃度，以一級動力學方程擬合實驗數據。

1.2.2.2 溫度對冠突散囊菌ET1降解CY速率的影響

將菌株ET1種子液按體積分數5%接種量接種至初始CY質量濃度為50 mg/L的PD培養基中(pH 6.0)，分別在 25、30、35 ℃，180 r/min 振蕩培養，分別在 0、1、2、3、4、5、6、7、8 d 取樣測定 CY 的殘留質量濃度，以一級動力學方程擬合實驗數據。

1.2.2.3 初始pH對冠突散囊菌ET1降解CY速率的影響

將菌株ET1種子液按體積分數5%接種量接種至初始CY質量濃度為50 mg/L的pH值分別為5.0、6.0、7.0的PD培養基中，30℃，180 r/min振蕩培養，分別在 0、1、2、3、4、5、6、7、8 d 取樣測定 CY 的殘留質量濃度，以一級動力學方程擬合實驗數據。

1.3 冠突散囊菌ET1降解CY途徑分析

1.3.1 GC-MS法分析冠突散囊菌ET1降解CY的中間產物

將冠突散囊菌ET1種子液按體積分數5%接種量分別接種至30 mL PD-CY(50 mg/L)中，30℃、180 r/min 振蕩培養，分別于 0、1、2、3、4、5、6、7、8 d 取整瓶培養液，加入等體積乙腈，超聲(40 kHz、300 W，30 min)輔助提取培養液中 CY，12 000 r/min離心10 min，收集上清液，混合各時間點樣品，用旋轉蒸發器濃縮至干，適量乙腈(HPLC)重溶后，加入適量無水Na2SO4除水24 h，12 000 r/min離心10 min，上清液用0.45 μm有機相濾膜過濾，棄去初濾液，取續濾液供GC-MS分析檢測。

GC-MS檢測條件:色譜柱HP-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，載氣為氦氣，GC 柱箱溫度為 90.0℃，進樣口溫度為250.0℃，進樣量為1 μL，壓力為min;進樣量 10 μL。107.4 kPa，總流量為 6.0 mL/min，柱流量為 1.50 mL/min，線速度為45.3 cm/s，吹掃流量為3.0 mL/min，分流比為1.0。

1.3.2 冠突散囊菌ET1對模式底物的利用情況

分別將3-苯氧基苯甲醛、3-PBA和苯酚添加到MM和PD中，使其質量濃度分別為50 mg/L。將菌株ET1種子液以5.0%接種量分別接種于MM-模式底物和PD-模式底物培養基中，并以接種等量的無菌生理鹽水作空白對照。30℃、180 r/min振蕩培養5 d，HPLC法檢測各培養液中模式底物的降解情況。

模式底物HPLC檢測色譜條件［22］:色譜柱Sepax GP-C18柱(150 mm × 4.60 mm，5.0 μm);流動相 A:pH 2.5的磷酸水溶液，B:乙腈。梯度洗脫:0～10 min，45% ～ 85%B(V/V);10 ～ 18 min，85%B(V/V);柱溫25℃，流速1.0 mL/min，檢測波長為210 nm，進樣量為10 μL。

2 結果與分析

2.1 冠突散囊菌ET1的生長曲線及對CY的降解曲線

比較菌株ET1在PD和PD-CY中的生長情況(圖1)，ET1在PD-CY與PD中的生長趨勢大致相同，最終細胞干重相差較小(4.50 g/L左右)，表明CY對菌株ET1的生長影響較小。

圖1 冠突散囊菌ET1的生長曲線及對CY的降解曲線Fig.1 The growth curve and biodegradation curve to CY of E.cristatum ET1

圖1顯示了冠突散囊菌ET1在PD-CY中對CY的降解情況，ET1從第1天開始對CY有降解，在2～6 d CY降解速率增長相對較快，6天后降解率變化較小，培養8天對CY的降解率為57.93%。與其生長曲線作對比看出，ET1對CY降解與其生長情況是同步的。

2.2 冠突散囊菌ET1降解CY的動力學特性

2.2.1 底物濃度對冠突散囊菌ET1降解CY速率的影響

不同CY質量濃度下冠突散囊菌ET1對CY降解速率的影響見表1，不同底物質量濃度下菌株ET1對CY降解符合一級反應動力學方程。底物濃度在20～100 mg/L CY半衰期變化相對較大。

表1 不同底物濃度下冠突散囊菌ET1降解CY的動力學方程Table 1 Kinetics equations for CY degradation at different CY concentrations by E.cristatum ET1

2.2.2 溫度對冠突散囊菌ET1降解CY速率的影響

溫度對冠突散囊菌ET1 CY降解的影響見表2，不同溫度條件下菌株ET1對CY降解符合一級反應動力學方程。在25～35℃，CY半衰期變化不大，25℃條件下ET1降解CY的半衰期略短。

表2 不同溫度條件下冠突散囊菌ET1對CY的降解動力學方程Table 2 Kinetics equation of degradation of CY at different temperatures by E.cristatum ET1

2.2.3 初始pH對冠突散囊菌ET1降解CY速率的影響

初始pH對冠突散囊菌ET1降解CY的影響見表3，不同初始pH條件下菌株ET1對CY降解符合一級反應動力學方程，初始pH為6.0時，ET1降解CY的半衰期最短。

表3 不同pH條件下冠突散囊菌ET1對CY的降解動力學方程Table 3 Kinetics equation of degradation of CY at different pH by E.cristatum ET1

在測試的CY質量濃度、溫度、pH值范圍內，CY半衰期為3.382～11.517 d，受底物濃度影響較大，CY質量濃度在20～100 mg/L范圍內，CY半衰期變化較大，隨著CY質量濃度的增加，其半衰期相應地延長，溫度和pH對CY半衰期的影響相對較小。

2.3 冠突散囊菌ET1降解CY途徑

2.3.1 冠突散囊菌ET1降解CY的中間產物

將ET1經PD-CY培養獲得的不同時間點的混合樣品進行GC-MS檢測，結果如圖2所示。

圖2 冠突散囊菌ET1的PD-CY培養體系各時間點混合樣品中CY代謝產物的質譜圖Fig.2 GC-MS spectras of metabolites from mixed samples taken from PD-CY cultures for E.cristatum ET1 at different time

結果表明，GC-MS檢測到中間產物3-苯氧基苯甲醛和苯酚。3-PBA是大多數擬除蟲菊酯類農藥的主要降解中間產物之一［14，24］，可能是樣品在檢測過程中，由于高溫或電離等原因3-PBA被加氫轉化為3-苯氧基苯甲醛［25］，所以GC-MS測定時未檢測到3-PBA。所以判定ET1降解CY的中間產物有3-PBA、3-苯氧基苯甲醛、苯酚。

2.3.2 冠突散囊菌ET1對模式底物的利用情況

冠突散囊菌ET1對3-苯氧基苯甲醛、3-PBA和苯酚等模式底物的利用結果見表4。由表4可知，菌株ET1在MM中不能生長，對各模式底物不能降解;而在PD中，ET1對各模式底物都有降解能力，表明菌株ET1不能直接利用各中間產物作為碳源生長，需要外加碳源才能對其進行降解。

表4 冠突散囊菌ET1對模式底物的降解情況Table 4 Utilization of model substrates by E.cristatum ET1

2.3.3 冠突散囊菌ET1降解CY途徑分析

根據Tallur等［13］對氯氰菊酯及其中間產物3-PBA降解途徑的研究結果，結合本文對冠突散囊菌ET1降解CY產物的GC-MS檢測結果，以及其對模式底物利用情況的分析結果，推測菌株ET1對CY的降解途徑可能見圖3。

圖3 冠突散囊菌ET1降解CY的可能途徑Figure.3 Proposed pathway for the biodegradation of CY by E.cristatum ET1

CY在冠突散囊菌ET1酯酶的作用下，CY分子中間酯鍵斷裂生成DCVA和α-氰基-3-苯氧基芐醇，α-氰基-3-苯氧基芐醇極不穩定，自發通過反應生成3-苯氧基苯甲醛，在脫氫酶的作用下，3-苯氧基苯甲醛轉化為3-PBA，3-PBA的醚鍵斷裂產生苯酚，苯酚可被菌株ET1利用降解。

目前關于微生物降解3-PBA的途徑已有部分研究，Tallur等［13］從3-PBA的降解產物檢測到苯酚，認為3-PBA二苯醚鍵斷裂直接分解生成苯酚和原兒茶酸，原兒茶酸和苯酚進一步降解，原兒茶酸苯環斷裂生成直鏈烯酸。Chen等［26］研究發現，3-PBA在加氧酶的作用下可以轉化為3-(2-羥基苯氧基)苯甲酸，進一步轉化為原兒茶酸、苯酚和3，4-二甲氧基苯酚;Tang等［27］通過研究證明，3-PBA在鞘氨醇單胞菌SC-1的作用下通過加羥脫羧反應轉化為羥基二苯醚，其醚鍵斷裂生成苯酚和鄰苯二酚。因此，3-PBA在冠突散囊菌ET1的作用下醚鍵斷裂分解為苯酚和何種物質以及苯酚的進一步降解途徑還需要進一步研究。

3 討論與結論

目前關于微生物修復食品中擬除蟲菊酯及其中間產物3-PBA的研究尚為鮮見。從食品原料中篩選安全無毒的降解菌株，揭示菌株的降解途徑和降解機理，判斷菌株對農藥的降解是否完全、降解產物是否無毒，對食品中擬除蟲菊酯類農藥的降解及消除具有重要意義。

來源于茯磚茶的“金花菌”——冠突散囊菌(Eurotium cristatum)ET1在測試條件下菌株ET1可有效降解20～100 mg/L質量濃度范圍內的CY，8 d對50 mg/L CY降解率達到57.93% ，且在25℃、pH 6.0的條件下，ET1降解50 mg/L CY的半衰期最短，為6.104 d。研究證明3-PBA、3-苯氧基苯甲醛和苯酚是菌株ET1降解CY的中間產物，菌株ET1在PD中，對各產物都有降解能力。本文初步推導了菌株ET1降解CY為3-PBA，再進一步降解得到苯酚，苯酚可被利用的降解途徑。本文研究結果為菌株ET1對被氯氰菊酯及其中間產物3-PBA污染的環境(土壤、水體等)或者農產品的修復以及其相關降解途徑的研究提供了數據參考。

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