醋酸菌冷凍、冷干保護劑的選擇

王娜，國石磊，張永祥，彭利沙，李軍

1(河北科技師范學院食品科技學院，河北秦皇島，066600)2(河北省果品加工工程技術研究中心，河北秦皇島，066600)

醋酸桿菌是一類重要的工業用菌，在食品和飲料工業生產以及工業化學品的生物轉化中都起著重要作用［1］。

低溫冷凍保藏是一種長期保藏菌種的簡便方法。菌懸液中加入適當保護劑放于冰箱中保存，一般－20℃下能保藏1年左右，－70℃下保藏時間更長，可達到10年以上，此保藏方法簡單易行，適合實驗室保藏菌種［2］。而冷凍干燥保藏菌種的方法為菌種保藏方法中最有效的方法之一，對一般活力強的微生物及其孢子以及無芽孢菌都適用，適用于菌種的長期保存，一般可保存數年至十余年。

保護劑無論對生物體還是生物大分子都有良好的非特異性保護作用，能夠顯著降低工藝處理中冷凍、干燥等逆境對菌體細胞膜、脂質體等造成的傷害，提高菌種存活率［3］。采用合適的保護劑加以深冷技術能有效地保藏菌種，制備發酵劑［4］。國內外關于保護劑在乳酸菌中的保護作用已有大量的研究，并且對各種保護劑的效果也有大量的數據報道［5－11］，但是針對醋酸菌保護劑的研究較少。研究表明，不是每種保護劑對所有菌種都有保護作用，由于細胞結構和大小都存在差異，不同微生物即使采用相同的保護劑所取得的效果也不盡相同［12］，不同的保護劑所發揮的效果具有菌株特異性的特點。

糖醇類物質是一類重要的保護劑，它們的共同點是有大量自由羥基，可與菌表面自由基聯結，形成保護膜，從而避免菌體暴露在介質中，還可與蛋白質形成氫鍵以取代水，保證蛋白質結構的穩定性［13］。同時糖醇類物質也可以降低冰晶體對菌體細胞的破壞作用，有利于細胞較快復水或修復受損細胞［14］。海藻糖作為一種廣泛存在于細菌、真菌、植物及很多無脊椎動物細胞內的非還原性二糖，具有高親水、化學穩定的獨特性質［15］。除此以外，常用作糖類保護劑的還有葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、葡聚糖等。高分子保護劑，如脫脂奶粉等溶于水時，溶液可呈過冷狀態，即在冰點以下的相同溫度該溶液中的溶質濃度較小，蛋白質鹽析變性也較少［16］。脫脂奶粉是一種較好的保護劑，其主要成分是蛋白質和糖類，特別是其中的乳清蛋白和乳糖能對菌種產生較好的保護作用，能以“包埋”的形式將菌體與外界不利環境隔離，減少由于細胞壁損壞而引起的胞內物質泄漏，從而起到保護作用。

為了考察不同保護劑對醋酸菌菌體細胞的保護作用，本文以醋化醋桿菌和巴氏醋桿菌巴士亞種為研究對象，比較10種不同的保護劑對它們的冷凍和冷干保護作用，為進一步研發保護劑配方提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

醋化醋桿菌(Acetobacter aceti，CICC 22519)，巴氏醋桿菌巴士亞種(Acetobacter pasteurianus ssp.pasteurianus，CICC7015)，均購自中國工業微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養基

液體活化培養基:葡萄糖2 g，酵母浸粉1 g，蒸餾水100 mL，pH自然，121℃滅菌20 min。

液體種子培養基:葡萄糖2 g，酵母浸粉1 g，蒸餾水100 mL，pH自然，121℃滅菌20 min。

液體發酵培養基:葡萄糖2 g，酵母浸粉1 g，Mg-SO4·7H2O 0.1 g，蒸餾水100 mL，pH 自然，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 保護劑

葡萄糖、甘露醇、蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、可溶性淀粉、葡聚糖、玉米糊精均為分析純試劑和生化試劑。脫脂乳粉為市售奶粉。

1.1.4 主要儀器與設備

FDU-1200型冷凍干燥機，日本EYELA東京理化;VOS301SD型真空干燥箱，日本EYELA東京理化;蒸汽滅菌鍋、生化培養箱和潔凈工作臺等實驗室常用儀器設備。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液制備

為確保實驗的一致性，每次培養前均從固體斜面培養上接種活化，30℃、170 r/min，振蕩培養24 h。隨后以10%接種量再次接入液體培養基，如前，培養24 h。所得到的液體種子培養物接種于100 mL液體發酵培養基中，30℃培養36 h至細胞穩定期。在無菌條件下，將培養物等量分裝于10 mL無菌離心管中，5 000 r/min離心10 min，迅速傾去上清液，收集細胞，用冷的磷酸緩沖溶液(pH 7.0)洗滌2次，再次離心收集。所得的菌體細胞加入等量的不同保護劑和磷酸緩沖溶液中，用渦旋混合器充分混勻后進行冷凍或冷干處理。

1.2.2 保護劑制備

將各種保護劑按要求用蒸餾水溶解，配制成質量濃度為10%的溶液，113℃滅菌40 min后備用。

1.2.3 菌體存活率測定

菌體存活率:稀釋平板計數法，樣品經適當倍數稀釋后涂布于固體瓊脂培養基上，每個稀釋度做3個重復，平皿置30℃培養48 h后菌落計數。

1.2.4 冷凍

經過不同保護劑懸浮的菌懸液置于－20℃下凍存12 h，室溫解凍后測定活菌數。

1.2.5 冷凍干燥

添加有不同保護劑的菌懸液均分裝于10 mL無菌離心管中，置冷凍干燥機中處理24 h。測定活菌數前先用磷酸緩沖溶液對處理后的樣品定量復水。

2 結果與討論

2.1 不同保護劑對菌體細胞冷凍的保護作用

為了研究不同保護劑對醋酸菌的冷凍保護能力，我們研究了冷凍處理后不同保護劑的作用，結果如圖1所示。對所得實驗數據進行單因素方差分析，結果見表1、表2。

圖1 不同保護劑對菌體細胞冷凍保護作用的比較Fig.1 Effect of different protectants on cell after freezing

表1 A.aceti冷凍保護劑的方差分析結果(n=3)Table 1 Variance analysis of the freezing protectants on A.aceti(n=3)

表1、表2的方差分析結果表明，不同保護劑對A.aceti和A.pasteurianus ssp.pasteurianus的冷凍保護效果的影響顯著性概率值均為P=0.000＜0.05，表明不同保護劑對A.aceti和 A.pasteurianus ssp.pasteurianus冷凍存活率的影響顯著(P＜0.05)。采用Duncan新復極差法對兩組數據進行的多重比較結果見表3。

表2 A.pasteurianus ssp.pasteurianus冷凍保護劑的方差分析結果(n=3)Table 2 Variance analysis of the freezing protectants on A.pasteurianus ssp.pasteurianus(n=3)

表3 冷凍保護劑的Ducan多重比較結果(n=3)Table 3 Multiple comparison of the freezing protectants(n=3)

從表3可看出，對于醋化醋桿菌菌株，可溶性淀粉和葡聚糖這2種保護劑的保護效果不佳，顯著低于磷酸緩沖液對照，其他的所選保護劑均要顯著高于對照的保護效果。海藻糖、玉米糊精和脫脂乳粉對醋化醋桿菌的冷凍保護作用最為突出，存活率均超過了50%，分別達到了73.58%、62.26%和60.38%，比緩沖溶液對照的24.53%提高了3倍左右。并且海藻糖、玉米糊精、脫脂乳粉之間也存在顯著差異(P＜0.05)，保護效果:海藻糖＞玉米糊精＞脫脂乳粉。

對于巴氏醋桿菌巴氏亞種菌株，10種不同的保護劑中，除了甘露醇的保護效果與緩沖溶液對照無顯著差異，其他9種保護劑的保護效果均顯著高于緩沖溶液對照。葡聚糖、脫脂乳粉、玉米糊精和海藻糖的冷凍保護效果則較為顯著，存活率分別達到了95.35%、89.53%、88.37%和52.32%，與緩沖溶液對照的2.33%相比分別提高了41倍、38倍、38倍和22倍。葡聚糖、脫脂乳粉、玉米糊精同海藻糖之間保護效果差異顯著(P＜0.05)，保護效果:葡聚糖＞脫脂乳粉＞玉米糊精＞海藻糖。

從圖1看出，小分子保護劑中海藻糖對兩種菌株的冷凍保護作用最好，而高分子保護劑中脫脂乳粉和玉米糊精都對2種菌株均有較好的保護效果。冷凍過程對細胞膜的破環主要在于胞內外冰晶的形成和對細胞膜透性的影響。冰晶形成后，細胞質中鹽濃度升高，造成胞內pH和離子強度改變，潛在的不利化學反應發生率提高［17］。研究表明，海藻糖具有穩定細胞膜和蛋白質結構、抗逆保護的作用［18］。在添加保護劑的情形下，冷凍過程中大量冰晶形成，體系中的可冷凍水含量降低，使保護劑的局部濃度大大提高，糖的玻璃化相轉變溫度從而提高，極易形成玻璃態，而處于玻璃態的體系往往更加穩定，不容易發生物理化學變化。在相同的條件下，海藻糖與其他糖類相比，顯示了最高的玻璃化相轉變溫度［19］。從這個層面上講，海藻糖更易形成玻璃態，這種玻璃態假說可能可以解釋其對細胞的冷凍保護作用。而高分子保護劑中，脫脂奶粉和玉米糊精的保護效果較好，其主要是在細胞表面起到保護作用，通過“包埋”形式保護菌體。

相比較2種菌株，在未加保護劑的情況下，冷凍對于巴氏醋桿菌巴士亞種的傷害更大，緩沖溶液對照組中，其存活率僅有2.33%，而醋化醋桿菌的對照存活率達到了24.53%，近似高出了10倍。并且海藻糖(二糖)對醋化醋桿菌菌株效果最好，玉米糊精、脫脂乳粉(大分子)效果次之;巴氏醋桿菌巴士亞種菌株則相反，葡聚糖、脫脂乳粉、玉米糊精等大分子的保護效果最佳，而海藻糖的效果次之。推測造成這些保護劑效果的差異可能是由于不同屬的菌株特性不同，培養過程中醋化醋桿菌的菌液比較黏稠，可能有較多的胞外多糖分泌，其本身的大分子物質對其菌株產生了一定的保護作用，這可能也是其未加保護劑能達到較高存活率的原因之一，因此小分子糖類對其的保護作用更顯著;而巴氏醋桿菌巴士亞種分泌的多糖相對較少，所以大分子的包埋保護作用顯得更明顯一些。這些推測還要靠進一步的研究加以證實。

2.2 不同保護劑對菌體細胞冷凍干燥的保護作用

冷凍干燥對細胞造成損傷的主要原因在于:冰晶形成、鹽濃度改變、細胞膜透性改變和代謝作用損傷。而保護劑在冷凍干燥過程中的保護作用，主要是其具有能與水結合、阻止胞內和胞外冰晶形成的能力。冷凍干燥處理后不同保護劑的作用結果如圖2所示。

圖2 不同保護劑對菌體細胞冷干保護作用的比較Fig.2 Effect of different protectants on cell after freeze-drying

對所得實驗數據進行單因素方差分析，結果見表4、表5。

表4 A.aceti冷干保護劑的方差分析結果(n=3)Table 4 Variance analysis of the freeze-drying protectants on A.aceti(n=3)

表5 A.pasteurianus ssp.pasteurianus冷干保護劑的方差分析結果(n=3)Table 5 Variance analysis of the freeze-drying protectants on A.pasteurianus ssp.pasteurianus(n=3)

表4、表5的方差分析結果表明，不同保護劑對A.aceti和A.pasteurianus ssp.pasteurianus的冷干保護效果的影響顯著性概率值均為P=0.000＜0.05，表明不同保護劑對A.aceti和A.pasteurianus ssp.pasteurianus冷干存活率的影響顯著(P＜0.05)。采用Duncan新復極差法對兩組數據進行的多重比較結果見表6。

從表6可以看出，對于醋化醋桿菌菌株，甘露醇、蔗糖、海藻糖同緩沖溶液對照的效果差異不顯著，其他的7種保護劑存在顯著差異。脫脂乳粉、乳糖、葡萄糖的保護效果較好，凍干存活率分別為92.86%、81.25%、46.88%，分別是對照的4.2倍、3.7倍和2.1倍。并且這三者之間也存在顯著差異(P＜0.05)，保護效果:脫脂乳粉＞乳糖＞葡萄糖。

表6 冷干保護劑的Ducan多重比較結果(n=3)Table 6 Multiple comparison of the freeze-drying protectants(n=3)

對巴氏醋桿菌巴士亞種菌株，葡萄糖、乳糖、麥芽糖與對照樣品比較差異不顯著，其余7種保護劑有顯著差異。脫脂乳粉和海藻糖的冷干保護效果較優，分別是對照的6倍和2.6倍，兩者之間差異顯著(P＜0.05)，凍干存活率:脫脂乳粉(72.92%)＞海藻糖(31.25%)。

從圖2可以明顯看出，脫脂乳粉對醋化醋桿菌和巴氏醋桿菌巴士亞種的冷凍干燥保護效果均是最好的。這是因為在干燥過程中，乳粉中的乳清蛋白能在菌體外形成蛋白衣保護層，對細胞加以保護，并且可以固定凍干的酶類，避免由于細胞壁蛋白質損壞而引起的胞內物質泄漏，同時乳中的其他成分，如乳糖等，同樣可以起到一定的抗逆保護作用。而海藻糖在冷干過程中的保護作用對巴氏醋桿菌巴士亞種比醋化醋桿菌顯著，表明不是每種保護劑對所有菌株都有明顯保護效果，由于細胞結構和大小都有所不同，對于不同菌株，即使采用相同的保護劑所取得的效果也有差異，所以需要實驗來加以確定。

3 結論

(1)對菌體冷凍處理后，小分子保護劑中以海藻糖對兩個菌株的保護效果最為顯著，大分子保護劑中玉米糊精、脫脂乳粉以及葡聚糖呈現出較好的保護效果，這4種保護劑可優先用于對這2個菌種的冷凍保護劑的進一步優化研究。

(2)對菌體冷凍干燥處理后，脫脂乳粉對2個菌株的保護作用最好，其次乳糖、葡萄糖和海藻糖也起到一定的保護效果，這4種保護劑可用于下一步這2個菌株的冷干保護劑配方研究。

(3)每種保護劑對不同菌株的保護效果不同，由于細胞結構和大小都有所不同，即使采用相同的保護劑所取得的效果也有差異，所以每一種保護劑對每一醋酸菌菌株的存活率的影響都應該逐一確定。

(4)不同的保藏方法，每種保護劑起到的作用也不盡相同，要根據具體的工藝條件確定保護劑。

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