藍莓中總黃酮的提取及抗氧化活性研究

古力齊曼·阿布力孜， 阿吾提·艾買爾， 迪麗努爾·馬里克

（新疆師范大學化學化工學院新疆烏魯木齊830054）

藍莓中總黃酮的提取及抗氧化活性研究

古力齊曼·阿布力孜， 阿吾提·艾買爾， 迪麗努爾·馬里克?

（新疆師范大學化學化工學院新疆烏魯木齊830054）

文章優選藍莓中總黃酮的最佳提取工藝，考察藍莓中總黃酮提取液的抗氧化活性。通過單因素試驗和L9（34）正交試驗，確定藍莓中總黃酮的最佳提取條件，通過清除OH·、DPPH·和O-2·以及還原力實驗來評價藍莓中總黃酮體外抗氧化能力，并與Vc進行了比較。藍莓中總黃酮的最佳提取工藝為：乙醇濃度40%、液料比1∶18（V∶m）、微波功率250W、超聲功率50W、提取溫度55℃、提取時間7min；在此工藝條件下，藍莓中總黃酮提取率最高，其含量達6.433%?？寡趸钚詼y定結果表明，藍莓中總黃酮的抗氧化性明顯高于Vc，而且對OH·、DPPH·和O-2·均有較好的清除能力。該方法簡單、快速，藍莓總黃酮是一種有效的自由基清除劑。

藍莓；總黃酮；超聲-微波輔助提取法；抗氧化活性

黃酮類化合物是一大類天然產物，是許多中草藥的有效成分［1］。它的存在形式有兩種，一種是游離的苷元，另一種是與糖等結合的苷［2］。黃酮的功效是多方面的，它是一種很強的抗氧劑［3］，能改善血液循環［4］、降低膽固醇。能降低心肌耗氧量，增加冠脈、腦血管血流量，明顯緩解心絞痛、抗心律失常等，對防治心肌梗塞、心律失常等也有重要療效［5］等諸多功效，已列為保健食品的一類功能因子。為此，筆者以藍莓果實為原料，采用超聲-微波輔助提取法研究藍莓果實中總黃酮的提取工藝，優選藍莓中總黃酮的提取工藝，并對提取液進行抗氧化活性研究［6-10］，為利用藍莓工業化生產黃酮類化合物提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料與試劑

藍莓果實（采自新疆伊寧市）、蘆丁準品中（國藥品生物制品檢定所）、乙醇（95%）、5%的亞硝酸鈉溶液、10%的硝酸鋁溶液、4%的氫氧化鈉溶液、Vc、DPPH自由基、去離子水、硫酸亞鐵溶液（AR）、雙氧水（AR）、水楊酸（AR）。

1.1.2 儀器設備

UV-7502PCS紫外可見分光光度計（上海京工實業有限公司）；RE-5220旋轉蒸發器（上海壘固儀器有限公司）；U-3310紫外可見分光光度計（日本日立公司）；電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備

精密稱取干燥至恒重的粉碎過的藍莓果實粉末1.0g于50mL圓底提取瓶中，在一定料液比、溶劑濃度、溫度、功率、提取時間等條件下→浸泡→超聲-微波提取→抽濾→濃縮，充分洗凈殘渣濾干燥后備用。

1.2.2 最大吸收峰的確定

精確吸取蘆丁溶液3.2mL，置于10mL的容量瓶中，加入35%的乙醇定容至5.4mL，加入0.3mL5%的亞硝酸鈉（NaNO2）溶液，搖勻，放置6min，加入0.3mL10%的Al2（SO4）3溶液混勻，放置6min，再加入4mL4%的氫氧化鈉溶液，混勻，靜置15min，以空白為對照，立即在400nm-600nm波長范圍內進行掃描，確定其最大吸收波長。最大吸收波長為508nm。

圖1 最大吸收波長

1.2.3 標準曲線制備及回歸方程建立

精確稱取蘆丁對照品40mg置于100mL的容量瓶中，加入體積分數為35%的乙醇定容，精確移取蘆丁對照品溶液0、0.2、0.4、0.8、1.6、2.4、2.8、3.2mL，用35%的乙醇定容至5.4mL，加入0.3mL5%的NaNO2溶液，搖勻，放置6分鐘，加入0.3mL10%的Al2（SO4）3溶液混勻，放置6分鐘，再加入4mL4%的NaOH溶液，混勻，靜置15分鐘，在最大吸收波長處測量吸光度，以吸光度（A）為縱坐標，濃度（C）為橫坐標，繪制蘆丁標準溶液的標準曲線?；貧w方程為：A=3.6818C＋0.0017，相關系數（r=0.9982）。

1.2.4 樣品總黃酮含量的測定

以藍莓殘渣為原料，經有機溶劑浸提總黃酮，提取液減壓過濾后定容至100mL，每次準確量取1.0mL。代入回歸方程（1）中計算，得出提取液中總黃酮含量。

總黃酮提取率（%）=C×100×100（w-w×b）×1000×100

式中w—樣品的重量（單位g）；C—提取液中總黃酮含量（單位mg／mL）；b—樣品的含水量（單位%）。

1.2.5 提取條件的優化

為了全面考察超聲—微波提取的最佳工藝參數，在單因素實驗的基礎上，以超聲功率、超聲溫度、料液比和超提取聲時間等4種因素進行L9（34）正交試驗，確定最優方案，因素水平如表1所示。

表1 因素水平表

1.2.6 抗氧化實驗

1.2.6.1 羥自由基清除率的測定

取7支試管各加入9mol／L的FeSO4mL，9mol／L的水楊酸-乙醇溶液1mL，樣品1mL（濃度分別是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6）再加入8.8mol／L的H2O21mL，放入37℃水浴中反應0.5h。以去離子水作為參比，空白組用去離子水代替樣品。以Vc（抗壞血酸）作為對照物，操作同上，在510nm處測定吸光度，重復做三次，取平均值代入下式計算清除率。

1.2.6.2 DPPH·清除率的測定

吸取不同質量濃度的樣品（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg／mL）2 mL，移入試管中，加0.04mmol／mL DPPH ·的乙醇溶液2.0 mL，置暗處30分鐘，重復做3次。在517 nm波長處測定吸光度，以空白作參比，按下式計算清除率。

式中，A0代表2 mL DPPH·溶液加入2 mL無水乙醇；

Aj代表2 mL提取液加入2 mL無水乙醇吸光度；

Ai代表2 mL提取液加入2 mL DPPH·溶液的吸光值。

取50 mol／L的Tris-HCl緩沖溶液（pH=8.2）4.5 mL，加入4.2 mL去離子水，混勻后在25℃水浴中保溫20 min，取出后立即加入在25℃水浴中預熱過的3 mmol／L的鄰苯三酚溶液0.3 mL（以10 mmol／L的HCl代替鄰苯三酚作為空白），混勻后立即倒入比色皿中，于420nm處每隔30 s測定吸光度1次，共測5 min，計算對照溶液吸光度隨時間的變化率A0。然后依照上面方法實驗，在加入鄰苯三酚前先加入1.0 mL總黃酮提取液，再加入3.2 mL去離子水，其余按上面方法操作，計算總黃酮提取液吸光度隨時間的變化率Ai。將A0和Ai代入下式計算總黃酮提取液對·的清除率

式中A0為空白的平均吸光度；Ai為樣品的平均吸光值。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果及分析

2.1.1 乙醇濃度對提取率的影響

1.0 g已烘干粉碎處理過的藍莓果實粉末加10mL。微波功率為300W，料液比10∶1，超聲功率50W，乙醇濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%。過濾，提取三次合并濾液在40℃-50℃左右濃縮。在508nm處測定吸光度，結果見圖2所示。

圖2 乙醇濃度因素對提取率的影響

由圖2可知，總黃酮提取率隨乙醇濃度增大而增大，當乙醇濃度40%后，提取率開始下降，從成本和得率來考慮，乙醇濃度為35%-45%較為合適。

2.1.2 料液比對提取率的影響

1.0 g已烘干粉碎處理過的藍莓果實粉末加10 mL其濃度為分別為65%乙醇，提取溫度55℃。微波功率為60W，超聲功率50W。其料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25過濾，提取三次合并濾液在40℃-50℃左右濃縮。在508nm處測定吸光度，結果見圖3所示。

圖3 料液比對提取率的影響

由圖3可知，總黃酮提取率跟料液比成正比，料液比達到1∶15時，提取率最大；1∶15后，提取率趨于下降，這是因藍莓果實中總黃酮含量有限，所以選擇料液比1∶10-1∶20為宜。

2.1.3 微波功率對提取率的影響

1.0 g已烘干粉碎處理過的藍莓果實粉末加10mL其濃度為65%的乙醇，提取溫度55℃，超聲功率50W，微波功率分別為100W、200W、300W、400W、500W過濾，提取三次合并濾液在40℃-50℃左右濃縮。在508nm處測定吸光度，結果見圖4所示。

圖4 功率因素對提取率的影響

由圖4可知，總黃酮提取率隨微波功率增大而緩慢升高，在200W時趨近于最大值，故選擇提取功率為100W-300W間較為合適。

2.1.4 提取時間對提取率的影響

1.0 g已烘干粉碎處理過的藍莓果實粉末加10mL其濃度為65%的乙醇，提取溫度55℃。微波功率為400W，超聲功率50W，提取時間分別為3min、6min、9min、12min、15min。過濾，提取三次合并濾液在40℃-50℃左右濃縮。在508nm處測定吸光度，結果見圖5所示。

圖5 時間因素對提取率的影響

由圖5可知，在3min至6min時提取率隨提取時間延長而逐漸升高。當提取時間大于6min時，藍莓中總黃酮的提取率下降。故提取時間以5min-7min較為合適。

2.2 超聲-微波總黃酮提取正交實驗

根據單因素實驗結果，按照L9（34）正交表進行正交實驗，正交因素水平如表2所示，實驗結果及數據分析見表2。

表2 正交試驗設計及結果

2.3 方差分析

表3 方差分析表

由表2可知，根據極差R分析，超聲-微波輔助提取藍莓中總黃酮的最佳工藝條件為A3B2C1D3即乙醇濃度40%、提取時間6min、微波功率150W、液料比1∶18。各因素對藍莓中總黃酮提取量的影響順序為：微波功率（C）＞料液比（D）＞乙醇濃度（A）＞提取時間（B）。從表3方差分析可知微波功率和料液比表現出顯著性差異，而乙醇濃度和提取時間未表現出顯著性差異。

2.4 抗氧化實驗結果

2.4.1 藍莓中總黃酮提取液對OH·的清除作用

利用Fenton反應，檢測藍莓提取液和Vc對OH·的清除作用，其結果如圖6所示。

圖6 藍莓中總黃酮與Vc對OH·的清除作用

由圖6可以看出，在所選質量濃度范圍內，提取液和Vc對OH·都有一定的清除能力，其效果與添量呈正相關性。隨著濃度的增大，對OH·清除能力也增加，呈現出較好的量效關系?？傸S酮和Vc對OH·清除率的IC50值分別為0.24 mg／mL和0.45mg／mL，總黃酮對羥自由基的清除率比Vc強約1.8倍。

2.4.2 藍莓中總黃酮提取液對DPPH·的清除作用

藍莓中總黃酮提取液對DPPH·的清除作用由圖7可看出，總黃酮和Vc都對DPPH·有一定的清除能力，而且，其清除能力隨著濃度的增加而增大?？傸S酮和Vc對DPPH·清除率的IC50值分別為0.15mg／mL和0.17mg／mL，藍莓中總黃酮對DPPH·的清除率比Vc稍強。

圖7 藍莓中總黃酮和Vc對DPPH·的清除

2.4.3 藍莓中總黃酮對超氧陰離子自由基的清除作用

圖8 藍莓中總黃酮和Vc對超氧陰離子自由基的清除

3 結論

正交實驗及方差分析結果表明，以藍莓為原料，采用超聲-微波輔助法提取黃酮，研究藍莓黃酮提取分離工藝。藍莓中總黃酮最佳提取工藝條件為：乙醇濃度為40%、液料比為1∶18、超聲功率50W、微波功率為250W、提取溫度55℃、提取時間7min。在此工藝條件下，藍莓黃酮提取率達到最大值，即6.644%。用法具有快速、高效、簡單、且無污染等特點。

藍莓提取液的抗氧化活性實驗結果表明，藍莓總黃酮不僅具有較強的還原能力，而且對OH·、DPPH·均有較好的清除能力，且在一定范圍質量濃度內對三者的清除作用呈現良好的量效關系。因而可知，藍莓果實具有較好的抗氧化活性，可以利用藍莓的這個特點制作各種抗氧化保健藥品，對藍莓的開發利用有重要意義，為科研工作者們制作該類藥品提供實驗基礎。

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Extraction of Total Flavonoids from Blueberries and Antioxidant Activity

Gulqiman·ABLIZ， Awut·AMAR， Dilnur·MALIK?
（Chemistry and Chemical Engineering，Xinjiang Normal University，Urumqi，Xinjiang，830054，China）

To optimize the best extraction conditions of total flavonoids from Blueberries and to exam the antiox?idant activity of total flavonoids extracts.Methods：Using the orthogonal test of L9（34）to determine the content of total flavonoids and the best optimum extractions and the antioxidant activity was evaluated by the methods of OH·、DPPH··and reducing power and compared with the antioxidant activity of Vc.Results：the extraction conditions of total flavonoids in Blueberries：40%vol ethanol solution、liquid／material radio 18∶1（V∶m）、ultrason?ic power was 50W、microwave power was 250W、extraction temperature was 55℃、extraction time was 7 minutes；Under such conditions，the yield of total flavonoids was 6.433%.Antioxidant activity results showed that antioxidant activity of the flavonoids from Blueberries was obviously higher than Vc，and OH·，DPPH·，and·all have good ability to remove.Conclusion：this method was simple、quick，Blueberry flavonoids is a kind of effective free radical scavenger.

Blueberry；Total flavonoids；Ultrasonic-microwave assisted extraction；Antioxidant activity

R284

A

1008?9659（2015）03?007?08

2015-06-05

新疆少數民族科技人才特殊培養計劃科研項目資助（201423121）。

古力齊曼·阿布力孜（1988-），女，新疆阿克蘇人，碩士研究生，主要從事天然產物的研究。

?［通訊作者］迪麗努爾·馬里克（1964-），女，新疆烏魯木齊人，教授，主要從事天然產物方面的研究。