Ccbe1病毒對喉癌Hep- 2細胞VEGF- C表達的影響

李文媛,劉艷翠,尹國華,馮克儉,王瑩牡丹江醫學院解剖教研室，黑龍江牡丹江　157011

Ccbe1病毒對喉癌Hep- 2細胞VEGF- C表達的影響

李文媛,劉艷翠,尹國華,馮克儉,王瑩
牡丹江醫學院解剖教研室，黑龍江牡丹江157011

[摘要]目的探討膠質和鈣結合EGF區域1（Collagen and calcium binding EGF domains 1,Ccbe1）病毒對人喉癌細胞系Hep-2細胞增殖及血管內皮生長因子-C(vessel endothelium growth factor C,VEGF-C)表達的影響。方法用1×102，1×104，1×106pfu/mL 的Ccbe1腺病毒作用喉癌Hep-2細胞，細胞分為對照組（PBS），Ccbe1病毒高、中、低劑量組。觀察各組細胞增殖情況，采用PCR檢測各組細胞VEGF-C mRNA的表達水平。結果與對照組比較，Ccbe1病毒各劑量組細胞增殖顯著增高，VEGF-C mRNA表達水平顯著上升，且均有顯著劑量依賴性，差異有統計學意義(P＜0.05)。結論Ccbe1病毒可能通過上調淋巴管生成因子VEGF-C表達促進喉癌細胞增殖和淋巴管生成。

[關鍵詞]Ccbe1病毒；VEGF-C；喉癌；Hep-2細胞

喉癌是我國東北地區最為常見的耳鼻咽喉科惡性腫瘤。發病率高，危害大。近年來，隨著分子生物學和細胞學的發展，一系列關于喉癌發病與治療的相關機制得到探討[1]。目前發現多種淋巴管生成因子參與喉癌的生長與淋巴管轉移，有研究表明Ccbe1（膠原和鈣結合蛋白表皮生長因子-域-1）作為新發現的一種淋巴管生成因子，在斑馬魚胚胎期進行Ccbe1基因沉默后，其淋巴管和血管完全喪失[1]。但關于Ccbe1對腫瘤細胞的影響尚不清楚。該實驗在2014年3月—2014年6月期間通過觀察Ccbe1病毒對喉癌Hep-2細胞增殖及VEGF-C的表達的影響，探討Ccbe1對腫瘤細胞淋巴管生成的作用機制。

1　材料與方法

1.1主要試劑

實驗時間：2014年3月—2014年6月。胎牛血清（美國Hyclon公司），CCK-8法（美國Sigma公司），PCR試劑盒（Invitrogen公司）；引物設計（大連寶生物公司）。

1.2細胞株培養和病毒干預分組

人喉癌細胞株Hep-2（中國科學院上海細胞生物研究所），依據參考文獻[3]進行培養，RPMI1640培養液（含10%胎牛血清），至對數期進行實驗，制成單細胞懸液（4×105/mL）。Ccbe1病毒（Ccbe1 Adenovirus Mouse，購于美國abm公司，No.80829A)，實驗分為空白對照組（PBS），Ccbe1低劑量組（1×102pfu/mL），Ccbe1中劑量組（1×104pfu/mL），Ccbe1高劑量組（1×106pfu/mL）。

1.3 CCK-8法檢測

取各組單細胞懸液種植于96孔培養板（每孔100 μL），培養48 h后加入10 μL的CCK-8溶液（sigma公司），常規CCK-8法檢測，酶聯免疫檢測儀上檢測每孔的吸光度值(OD490)。

1.4實時熒光定量PCR檢測

總RNA提取，采用Pollmann等[4]報道方法進行PCR反轉錄、檢測及熒光定量分析。VEGF-C以及β-actin的引物的序列為: VEGF-C，上游5′-CTACAGATGTGGGGGTTGCT -3′，下游5′-CATCCAGCTCCTTGTTTGGT -3′；NF-κB，上游5′-GAAGAAGCGAGACCTGGA-3′，下游5′-TCCGGAACACAATGGCCA -3′；βactin，上游5′-TGGTGGGTATGGGTCAGAAGGACTC-3′，下游5′-CATGGCTGGGGTGTTGAAGGTCTCA-3′，分析方法利用2-△△CT方法。

1.5統計方法

所得數據采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。計量資料連續型變量采用（）表示，多組間均數比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1Ccbe1對Hep-2細胞增殖的影響

培養1 d后，與對照組相比，Ccbe1各干預組能夠顯著促進Hep-2細胞生長，中劑量組和高劑量增殖高于低劑量組，差異有統計學意義(P＜0.05)，培養3 d和5 d后，Ccbe1各干預組增殖增高，差異有統計學意義(P＜0.01)，其中Ccbe1高劑量組較中劑量組和低劑量組增殖更為顯著，差異有統計學意義(P＜0.05)。其促進作用呈濃度依賴性（見表1）。

表1　CCK-8法檢測Ccbe1對Hep-2細胞增殖增殖影響[n=6,（±s）]

表1　CCK-8法檢測Ccbe1對Hep-2細胞增殖增殖影響[n=6,（±s）]

注：*與對照組比較，P＜0.01，#與低劑量組比較，P＜0.05，△與中劑量組比較，P＜0.05。

對照組低劑量組中劑量組高劑量組組別0.025±0.09 （0.046±0.011）*（0.075±0.012）*#（0.082±0.015）*#1 d 0.112±0.015 （0.235±0.024）*（0.299±0.019）*#（0.367±0.023）*#△0.321±0.025 （0.535±0.034）*（0.639±0.036）*#（0.727±0.023）*#△3 d　5 d

2.2各組細胞VEGF-C mRNA相對表達水平比較

與對照組比較，Ccbe1病毒低、中、高劑量組VEGF-C mRNA相對表達水平顯著增高，差異有統計學意義(P＜0.05)，其中Ccbe1病毒高劑量組VEGF-C mRNA相對表達水平顯著高于Ccbe1病毒低、中劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05)，見表2。

3　討論

喉癌是耳鼻咽喉科最常見的惡性腫瘤，在我國東北地區發病率逐年上升，其中近95%患者為鱗狀上皮癌，其細胞系為hep-2細胞，盡管近年來相關治療如激光切除術和化學藥物治療已取得了較大進展，但淋巴管轉移和復發率仍高達20%，因此，開發新的有效治療喉癌淋巴管轉移的方法已尤為迫切。

表2　各組細胞VEGF-C mRNA相對表達水平比較[n=6,（±s）]

表2　各組細胞VEGF-C mRNA相對表達水平比較[n=6,（±s）]

注：*與對照組比較，P＜0.01，#與低劑量組比較，P＜0.05，△與中劑量組比較，P＜0.05。

對照組低劑量組中劑量組高劑量組組別0.0015±0.0006 （0.0026±0.0004）*（0.0038±0.0005）*#（0.0052±0.0006）*#△VEGF-C mRNA

以往研究已經證實喉癌中VEGF-C表達上調，但對于VEGF-C在喉癌細胞系方面的研究仍存在爭議[3]。VEGF-C能夠選擇性增強淋巴管內皮細胞有絲分裂；刺激內皮細胞增生并促進淋巴管生成；參與淋巴管外基質重塑。到目前為止已有大量的研究證明在胚胎發育、組織再生和腫瘤的生長過程VEGF-C在淋巴管新生過程中有極其重要的作用[1]。最近發現的分泌蛋白Ccbe1是淋巴管生成不可或缺的重要生成因子。研究發現[2]在斑馬魚、小鼠和人類，Ccbe1基因突變導致淋巴管增生和淋巴水腫（Hennekam綜合征），Ccbe1促進淋巴管新生并且可能參與腫瘤細胞的增殖。此外，發現胚胎期在一些組織Ccbe1和其他的淋巴管生成因子表達下降，并證實Ccbe1能夠獨立調節淋巴管生成。但Le等[5]發現Ccbe1在卵巢癌細胞株中顯著下調，與卵巢癌的發生和發展呈負相關。前期研究[6-7]證實喉癌中Ccbe1表達顯著增高，參與喉癌淋巴管生成和血管生成，該研究從體外實驗探討Ccbe1的作用機制。

Jeltsch[2]表明Ccbe1是VEGF-C活化的必要條件，VEGF-C信號通路可能是Ccbe1作用的重要下游信號通路。該研究CCK-8法結果表明，Ccbe1各干預組能夠顯著促進Hep-2細胞生長，其中3 d和5 d，Ccbe1高劑量組較中劑量組和低劑量組增殖更為顯著，顯示Ccbe1干預組能夠顯著促進喉癌hep-2細胞增殖，并具有濃度依賴性，證實了Ccbe1能夠促進Hep-2細胞增殖能力，這與Pollmann等的研究結果相一致[4，8]。但Ccbe1的作用機制目前尚不明確，該研究發現與對照組比較，Ccbe1病毒各劑量組VEGF-C mRNA表達水平均顯著上升，其中Ccbe1病毒高劑量組VEGF-C mRNA相對表達水平顯著高于Ccbe1病毒低、中劑量組，高于對照組4～5倍，VEGF-C是重要的淋巴管生成因子，因此我們推測Cebe1可能通過上調VEGF-C信號通路發揮作用。

綜上所述，該研究證實了Ccbe1能夠上調喉癌hep-2細胞中VEGF-C表達，提示Ccbe1可能通過活化VEGF-C，促進喉癌細胞增殖和淋巴管轉移。

[參考文獻]

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[2]Jeltsch M, Jha SK, Tvorogov D,et al. CCBE1 enhances lymphangiogenesis via A disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs-3-mediated vascular endothelial growth factor-C activation[J].Circulation, 2014,129(19):1962-1971.

[3]Xu Y, Yuan L, Mak J,et al. Neuropilin-2 mediates VEGF-C-induced lymphatic sprouting together with VEGFR3[J]. J Cell Biol，2010，188(1): 115-130.

[4]Pollmann C, Hogerling R, Kiefer F. Visualization of lymphatic vessel development, growth, and function[J].Adv Anat Embryol Cell Biol, 2014,214(3):167-86.

[5]Barton CA,Gloss BS,Qu W,et al.Collagen and calcium-binding EGF domains 1 are frequently inactivated in ovarian cancer by aberrant promoter hypermethylation and modulates cell migration and survival[J].Br J Cancer,2010,102(1):87-96.

[6]李文媛,王瑩,劉艷翠,等.膠原和鈣結合EGF域1的表達與直腸癌組織淋巴管生成及預后的關系[J].中國老年學雜志，2014，34(14): 3849-3851.

[7]李文媛,王瑩,孫平,等.喉癌組織中Ccbe1、VEGF-D的表達變化及意義[J].山東醫藥, 2013,53（23）:21-24.

[8]Zou Z, Enis DR, Bui H, et al.The secreted lymphangiogenic factor CCBE1 is essential for fetal liver erythropoiesis[J].Blood, 2013 ,121(16): 3228-36.

Impact on VEGF-C Expression of Ccbe1 Virus to Laryngeal Cancer Hep-2 Cells

LI Wen-yuan,LIU Cui-yan,YIN Guo-hua,FENG Ke-jian,WANG Ying
Department of Anatomy, Mudanjiang Medical University, Mudanjiang, Heilongjiang Province, 157011 China

[Abstract]Objective To investigate the impact on Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) expression of Collagen and calcium-binding EGF domain-containing protein 1 (Ccbe1) virus to laryngeal cancer Hep-2 Cells. Methods Cells were divided into control group (PBS), Ccbe1 virus in high, medium and low dose group, by the way of Ccbe1 adenovirus (in respective units 1× 102, 1×104, 1×106pfu/mL) acting on laryngeal cancer Hep-2 Cells. The cell proliferation was observed and the expression level of VEGF-C mRNA was detected by PCR for each group. Results Compared with the control group, the cell proliferation of Ccbe1 virus was significantly higher in each group, and the VEGF-C mRNA expression level was significantly increased than that in control group (P<0.05), and there were significant dose-dependence. Conclusion Ccbe1 virus may upgrade Lymph vessel generation factor VEGF-C expression to promote hep-2 cells proliferation and lymphatic formation in laryngeal cancer.

[Key words]Collagen and calcium-binding EGF domain-containing protein 1 (Ccbe1) virus; Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C); Laryngeal cancer; Hep-2 cell

[中圖分類號]R739.65

[文獻標識碼]A

[文章編號]1674-0742（2015）07（c）－0010-03

[基金項目]黑龍江省教育廳科研項目（12531745）

[作者簡介]李文媛（1980-），女，黑龍江伊春人，碩士，講師，主要從事腫瘤淋巴管生成機制研究。

[通訊作者]王瑩( 1977-)，男，黑龍江哈爾濱人，博士，副教授，研究方向:腫瘤發生機制。

收稿日期：（2015-04-25）