阿托伐他汀對自發性高血壓大鼠左室肥厚的影響及其可能機制

蒲麗君，趙珂，羅勇川北醫學院附屬醫院心內科，四川南充637000

阿托伐他汀對自發性高血壓大鼠左室肥厚的影響及其可能機制

蒲麗君，趙珂，羅勇
川北醫學院附屬醫院心內科，四川南充637000

[摘要]目的應用阿托伐他汀抑制自發性高血壓大鼠出現左室肥厚心肌過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）和p21表達及其改善機制。方法隨機將同批次16只具有8周齡的自發性高血壓大鼠分為阿托伐他汀ATV組與自發性高血壓SHR組（各8只）；另選取8只同周齡大鼠作為正常血壓WKY組。采用阿托伐他汀對ATV組進行灌胃，50 mg/（kg·d）；對SHR組與WKY組進行等容量蒸餾水灌胃，測量3組大鼠血壓，5周/次；持續干預10周后，對其血壓及血脂水平進行觀察與測量，同時計算其心肌肥厚指標，并使用RT-PCR、免疫組化觀察PPARγ和p21的表達。結果血脂及血壓觀測結果顯示，SHR組與ATV組無顯著差異，ATV組心肌肥厚指標明顯低于SHR組，差異有統計學意義（P<0.01）；ATV組PPARγ和p21的表達明顯高于SHR組，差異有統計學意義(P<0.01)。心肌組織PPARγ和p21 mRNA的表達表現出負相關性。結論阿托伐他汀可自行對自發性高血壓大鼠心肌細胞中PPARγ、p21上調以對細胞周期進行調節，對高血壓左室肥厚具有改善作用。

[關鍵詞]激活受體γ；p21；自發性高血壓大鼠；左室肥厚；阿托伐他汀

心血管疾病常見病之一高血壓，其心臟彩超顯示心臟由于長期受壓超負荷下為左心室肥厚，同時左室肥厚也是心臟終末心衰發展過程的共同基礎，同時也是引發高血壓患者出現嚴重心血管疾病的重要危險因素。參與這一病理生理過程的因素較為多樣且復雜，常規除去高血壓的影響外，細胞的增殖與凋亡失衡也與其關系密切。多種蛋白及基因對細胞的增殖與凋亡進行調控。其中過氧化物酶體增值物激活受體γ（PPARγ）是細胞分化過程中的重要轉錄因子，主要參與脂質及糖代謝，并在細胞增殖凋亡過程中發揮重要調控作用，其在高血壓發展與左室肥厚的關系探究中具有重要觀察意義。p21可促導細胞的增殖與分化，其實增殖細胞周期的負性調節因子。他汀類藥物除具有調節血脂的作用外還能夠發揮心血管保護效應，大量研究表明阿托伐他汀可抑制膠原蛋白的合成，有抗氧化、抗炎的作用，使其可以對高血壓左室肥厚進行干預和影響。但有關基因PPARγ、p21是否參與其中目前研究較少。該研究于2014年8月12日—2014 年10月14日以SHR為實驗模型，探討阿托伐他汀、高血壓左室肥厚以及PPARγ、p21之間的聯系和影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物與分組

實驗開始于2014年8月12日，歷時10周到2014年10月14日結束。24只大鼠均于重慶藤清生物技術有限公司購入，其中16只同批次的SHR、ATV以及8只WKY大鼠，均為體重在120～150 g的8周齡雄性大鼠，清潔級。將16只8周齡自發性高血壓大鼠隨機分為兩組各8只，分別為阿托伐他汀組(ATV組)與自發性高血壓對照組（SHR組）；另選取8只同周齡大鼠作為正常血壓WKY組。對ATV組進行阿托伐他汀(輝瑞制藥有限公司)灌胃，50 mg/（kg·d）；對SHR組與WKY組進行等容量蒸餾水灌胃，測量3組大鼠血壓，5周/次；持續干預10周后，每隔5周測1次血壓。10周后,觀察大鼠血壓、血脂水平，計算心肌肥厚指標，采用免疫組化及RT-PCR觀察PPARγ和p21的表達。

1.2血壓測定

采用尾袖法無創式測大鼠血壓，從第八周齡開始，每5周測血壓1次。

1.3左室質量指數

10周后大鼠空腹稱取體重（BW），使用2.5%戊巴比妥鈉進行注射麻醉，劑量50 mg/kg，腹主動脈抽取2 ml血液進行檢測，分別檢測TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。將大鼠心臟取出吸干并稱其重量（HW），并分離出左心室（包括室間隔），沖洗及吸干后稱取左心重(LVW)；計算心臟重量與體重的比值（HW/BW）以及左心室重點與體重的比值（LVW/BW），并以此作為判斷心肌肥厚的指標。自心尖部取心肌組織約4 mm放入10%甲醛內固定，用于制備組織蠟塊。剩余左心室組織保存于-80℃冰箱內用于提取RNA。

1.4血脂測定

將采集的腹主動脈血離心分離得到血清，采用Hitachi全自動化學分析儀測定血清中TC、TG、LDL-C及HDL-C的水平。

1.5心肌組織形態學檢測

將石蠟包埋的心肌組織用石蠟冰凍切片機（LEICA SM 2500E）切片，厚度為4μm，HE染色，電子顯微鏡下觀察心肌細胞形態。

1.6心肌細胞p21、PPARγ的分布

嚴格按照SABC試劑盒說明書進行操作。使用由美國Santa Cruz公司生產的鼠抗鼠p21單克隆抗體以及鼠抗鼠PPARγ單克隆抗體作為一抗；由中國武漢博士德生物工程公司生產的羊抗鼠IgG作為二抗。光學顯微鏡下顯示，心肌細胞正常狀態下呈藍色細胞核，p21、PPARγ的表達呈棕色（+）。每只大鼠均隨機抽取5張切片在×400的高倍鏡下觀察陽性心肌細胞所占比例，計算其蛋白的表達率。

1.7心肌組織p21、PPARγ mRNA表達水平

取100 mg心肌細胞標本，采用TRIzol法對標本進行總RNA提取，并使用UV-2500紫外線分光光度計算RNA純度，取2 μg總RNA根據逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄反應,制備cDNA ,作為PCR反應的模板。使用中國上海生工生物工程公司合成的引物具體見表1。在94℃溫度下預變5 min，后進入30個循環。預變過程：預變30 s后溫度降至56℃退火，30 s，溫度升至72℃延伸30 s，最后溫度定為74℃延伸5 min。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳PCR終產物8 μL，時間約40 min，采取凝膠成像儀對條帶的灰度值進行分析，計算基因、GAPDH的灰度比作為mRNA的表達相對量。

表1　目的基因及內參照GAPDH基因的引物序列

表3　ATV對大鼠血脂及心肌肥厚指標的影響（±s）

表3　ATV對大鼠血脂及心肌肥厚指標的影響（±s）

注：與WKY組比較，aP<0.05；與SHR組比較，bP<0.05。

WKY（n=8）SHR（n=8）ATV（n=8）組別0.53±0.09 (0.31±0.07)a(0.35±0.11)aTG (mmol/L) 2.44±0.32 (1.36±0.18)a(1.37±0.11)aTC (mmol/L) 0.91±0.20 (0.41±0.11)a(0.39±0.06)aLDL-C (mmol/L) 1.29±0.14 (0.83±0.07)a(0.82±0.07)aHDL-C (mmol/L) 3.36±0.21 (4.48±0.47)a(3.90±0.40)ab2.82±0.18 (3.77±0.47)a(3.26±0.29)abHW/BW (mg/g) LVW/BW (mg/g)

1.8統計方法

采用統計軟件包SPSS 17.0對所有數據進行分析，計量資料用均數±標準差（）表示，多組間變量的比較采用單因素方差法分析，以P<0.05認為差異有統計學意義。采用Spearman相關分析PPARγ和p21 mRNA的表達與心肌肥厚指標的相關性。

2　結果

2.1阿托伐他汀藥物對血壓、血脂水平的影響

ATV組和SHR組的血壓均顯著高于WKY組，差異有統計學意義（P<0.01），而ATV組和SHR組兩組間的血壓，差異無統計學意義（P>0.05），見表2。10周后，ATV、SHR兩組血脂水平均明顯低于WKY組，差異有統計學意義（P<0.05），在阿托伐他汀干預后ATV組血脂水平與SHR組相比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表3。

表2　各組大鼠血壓值[mmHg，（±s）]

表2　各組大鼠血壓值[mmHg，（±s）]

注：與WKY組比較，aP<0.01。

WKY（n=8）SHR（n=8）ATV（n=8）組別收縮壓舒張壓收縮壓舒張壓收縮壓舒張壓血壓141.0±16.0 100.5±11.2 （162.0±32.6）a（122.4±15.9）a（160.8±31.9）a（121.0±24.6）a8 weeks 141.7±19.2 99.4±10.3 （178.1±24.7）a（131.4±22.1）a（175.2±30.3）a（127.9±31.2）a142.0±15.9 96.9±10.5 （182.6±26.2）a（135.8±21.2）a（176.5±27.6）a（134.6±20.8）a13 weeks　18 weeks

2.2阿托伐他汀藥品對心肌肥厚指數的影響

對比發現，SHR組大鼠HW/BW、LVW/BW明顯高于WKY組大鼠；ATV組上述指標均降低且與SHR組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，但并未降至正常水平，與WKY組比較，差異有統計學意義（P<0.05），具體結果見表3。

2.3心肌組織的光鏡下觀察

WKY組：形態正常，排列整齊，無明顯肥大；SHR組：形態異常、排列紊亂，明顯肥大，部分心肌纖維出現斷裂；ATV組：介于WKY、SHR兩組之間，形態及排列較SHR組相比較為整齊規則，心肌纖維斷裂較少，細胞肥大較少。見圖1。

圖1　心肌組織病理形態學改變（HE染色，×400）A:WKY組；B:SHR組；C:ATV組。

2.4免疫組化檢測結果

結果顯示：p21、PPARγ蛋白均在大鼠心肌細胞核內表達，SHR組和ATV組PPARγ和p21蛋白的（+）表達率均低于WKY組，差異有統計學意義（P<0.05）；ATV干預后，PPARγ和p21的（+）表達率明顯上升，ATV組高于SHR組，差異有統計學意義（P<0.05），見圖2、圖3。

圖2　免疫組化觀察心肌細胞PPARγ蛋白表達（×400）A:WKY組；B:SHR組；C: ATV組。表達（+）的心肌細胞核呈棕黃色（如白色箭頭所示），表達（-）的心肌細胞核呈藍色（如黑色箭頭所示）

圖3　免疫組化觀察心肌細胞p21蛋白表達影響（×400）A:WKY組；B:SHR組；C:ATV組

2.5RT-PCR結果

結果顯示：SHR、ATV兩組大鼠p21、PPARγ mRNA相對表達量均低于WKT組大鼠，差異有統計學意義（P<0.05）；ATV干預后，p21、PPARγ mRNA的表達均上升，ATV組高于SHR組，差異有統計學意義（P<0.05），見圖4、表4。

A組　B組C組Marker A組　B組C組Marker圖4 PPARγ、p21的電泳圖A:WKY組；B:SHR組；C:ATV

表4　阿托伐他汀對PPARγ、p21mRNA表達的影響（±s）

表4　阿托伐他汀對PPARγ、p21mRNA表達的影響（±s）

注：與WKY組相比較aP<0.05；與SHR組相比較*P<0.05。

PPARγ P21基因1.26±0.03 1.12±0.05 WKY組（1.02±0.03）a（0.81±0.08）a（1.12±0.04）ab（0.98±0.07）abSHR組　ATV組

2.6p21、PPARγ mRNA與心肌肥厚相關性

p21 mRNA的表達與HW/BW、LVW/BW均呈高度負相關，差異有統計學意義（r=-0.708、-0.667，P<0.0001）；PPARγ mRNA的表達與HW/BW、LVW/BW同樣均呈高度負相關，差異有統計學意義（r=-0.859、-0.902，P<0.0001）。

3　討論

高血壓可使心肌肥厚、心室重構，是對心臟損傷的表現之一，也是引起心血管事件的獨立危險因素[1]。研究表明，他汀類藥物除降脂外還可干預細胞周期，以此對多種腫瘤細胞和血管平滑肌細胞進行增殖與凋亡調節，但現如今對心肌細胞增殖與凋亡是否也通過干預細胞周期改善心室重構目前尚不清楚。

近年有研究表明，在心肌肥厚的發病機制中，p21參與其中并起到重要作用。在國外學者的研究中表明，左心室肥厚可使p21蛋白表達能力下降，引起心肌細胞肥大[4]。且還有學者對阿托伐他汀的研究中發現，他汀類藥物可通過下調細胞周期蛋白相關的抑制蛋白促進細胞周期蛋白的表，使細胞衰老過程減慢。也有研究表明，他汀類藥物主要通過對p21、p27的調節實現對腫瘤細胞周期調節的過程[5]。該實驗結果表明，p21表達降低可介導心肌細胞的肥大、促進心肌細胞增殖，從而參與心肌肥厚的發生。

有研究表明[6]PPARγ的活化可能與心肌細胞肥大的負性調節有關,可抑制心肌細胞增殖，進而改善心室重構。在過去的研究中人們發現，阿托伐他汀對大鼠心肌中PPARα、PPARβ、PPARγ的表達有促進作用，明顯減少了左心室壁的厚度，逆轉心室重構[7]。也有學者對壓力負荷誘導心肌肥厚的大鼠進行研究，結果發現，阿托伐他汀可使左心室壁厚度減小，上調PPARγ蛋白的表達。因此, PPARγ的激活應用阿托伐他汀改善心肌肥大的作用有極大關系。在該實驗中，PPARγ表達上調可改善心肌肥厚癥狀，也證實了PPARγ表達可對心肌肥厚起到負調控作用，與既往研究基本相符[8]。

在心血管方面，Li M等[ 9]在體外的研究結果表明，PPARγ活化可通過誘導血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1)的表達及上調p21的表達來抑制大鼠肺動脈平滑肌細胞的增殖。Zhang D等[ 10]在體內實驗中也同樣表明，肺動脈高壓大鼠PPARγ的激活可明顯降低右心室的收縮壓，抑制右心室肥厚，部分抑制肺血管的重構，其機制可能與上調HO-1 and p21的表達有關。通過該研究可推測，阿托伐他汀可激活心肌PPARγ進行表達，間接影響p21表達上調，在兩者共同作用下抑制了心肌肥大、心室重構等癥狀，而具體作用機制有待進一步深入研究。

該研究中還發現，阿托伐他汀并不影響血脂水平，結果提示其對心臟的改善作用與血壓無關，但本文研究樣本較小，可能影響此結果。

綜上，阿托伐他汀可自行對自發性高血壓大鼠心肌細胞中PPARγ、p21上調以對細胞周期進行調節，對高血壓左室肥厚具有改善作用。

[參考文獻]

[1]Yang W，Qi Q，Zhang H，et al. p21 (Waf1/Cip1) Polymorphisms and Risk of Esophageal Cancer[J]. Ann Surg Oncol，2010,17(5)：1453-1458.

[2]Chen J.Contribution of p16IN4Ka and p21WAF1 pathways to induction of premature senescence of human endothelial cells:permissive role of p53[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2005,290(4):H1575-1586.

[3]Chai J,Charboneau AL,Betz BL,et al.Loss of the hSNF5 gene concomitantly inactivates p21CIP/WAF1 and p16IN4Ka activity associated with replicative senescence in A204 rhabdoid tumor cells[J].Cancer Res, 2005,65(22):10192-10198.

[4]Kramer DL,Chang BD,Chen Y,et al.Polyamine depletion in human melanoma cells leads to G1 arrest associated with induction of p21WAF1/CIP1/SDI1,change in the expression of p21WAF1-regulated genes,and a senescence-like phenotype[J].Cancer Res,2001，61(21): 7754-7762.

[5]Tanner FC,Boehm M,Akyurek LM,et al.Differential effects of the cyclindependent kinase inhibitors p27 (Kipl), p21(cip1), andp16(Ink4)on vascular smooth muscle cell Proliferation[J].Circulation，2000,101(17): 2022-2025.

[6]Assmus B,Urbich C,Aicher A,et al.HMG-CoA reductase inhibitors reduce senescence and increase proliferation of endothelial progenitor cells via regulation of cell cycle regulatory genes [J].Circ Res,2003，92 (9):1049-1055.

[7]Han L, Li M, Liu Y, et al. Atorvastatin may delay cardiac aging by upregulating peroxisome proliferator-activated receptors in rats [J].Pharmacology, 2012, 89(1-2): 74-82.

[8]Grip O, Janciauskiene S, Lindgren S.Atorvastatin activates PPAR-gamma and attenuates the inflammatory response in human monocytes [J]. Inflamm Res, 2002, 51 (2) : 58-62.

[9]Li M, Li Z, Sun X, et al.Heme oxygenase-1/p21WAF1 mediates peroxisome proliferator-activated receptor-gamma signaling inhibition of proliferation of rat pulmonary artery smooth muscle cells[J].FEBS J, 2010, 277(6):1543-1550.

[10]Zhang D, Wang G, Han D,et al. Activation of PPAR-γ ameliorates pulmonary arterial hypertension via inducing heme oxygenase-1 and p21(WAF1): an in vivo study in rats[J]. Life Sci. 2014 ,98(1):39-43.

Effects and its Underlying Mechanism of Atorvastatin on Spontaneously Hypertensive rats with Left Ventricular Hypertrophy

PU Li-jun, ZHAO Ke, LUO Yong
Department of Cardiology, Affiliated Hospital of Chuanbei Medical College, Nanchong, Sichuan Province, 637000 China

[Abstract]Objective To investigate the effect of atorvastatin on peroxisome proliferator-activated receptor-γ(PPARγ) and p21 expression of hypertrophic myocardium in spontaneously hypertensive rats and discuss the underlying mechanisms which atorvastatin improves left ventricular hypertrophy. Methods 16 eight -week -old male spontaneously hypertensive rats were randomly divided into atorvastatin group (ATV group, n=8) and spontaneously hypertensive rats group (SHR group, n=8). Age–matched Wistar - kyoto rats were served as normal blood pressure control group (WKY group, n=8). In ATV group, atorvastatin was given at a dose of 50 mg/(kg·d) perday by gastric gavage, and in SHR and WKY group, the same volume of distilled water by gavage. Measure the blood pressure every five weeks. Ten weeks later, blood pressure and plasma lipid levels were measured. The ratio of the heart weight to body weight (HW/BW) and the left ventricular weight to body weight (LVW/BW) were calculated as myocardial hypertrophy index. The expressions of PPARγ and p21 were investigated by the method of immunohistochemistry analysis and RT-PCR. Results There was not much difference of plasma lipid levels and blood pressure between ATV and SHR group. Compared with SHR group, Myocardial hypertrophy index decreased significantly in ATV group (P<0.01). The myocardium PPARγ and p21 expression increased significantly (P<0.01). The association between expression of PPARγmRNA and p21mRNA in cardiomyocytes and myocardial hypertrophy index are negative correlation. Conclusion Atorvastatin increases myocardium PPARγ and P21 expression and improves left ventricular hypertrophy in spontaneously hypertensive rats.

[Key words]Peroxisome proliferator-activated receptor-γ; P21; Spontaneously hypertensive rats; Left ventricular hypertrophy; Atorvastatin

[中圖分類號]R544.1

[文獻標識碼]A

[文章編號]1674-0742（2015）07（c）－0012-04

[基金項目]川北醫學院苗圃基金（MP-ZK-24）

[作者簡介]蒲麗君（1978.4-），女，四川南充人,碩士，主治醫師，研究方向:高血壓病心衰的發病機制。

[通訊作者]羅勇（1966.2-），男，四川南充人，碩士研究生，教授，主要從事心血管疾病臨床與基礎研究。

收稿日期：（2015-04-25）