霍山石斛快速繁殖技術研究

方香香，謝歡，伍奧林，張壽文*

(1江西中醫藥大學，江西 南昌 330004；2江西中醫藥大學科技學院，江西 南昌 330004)

·專題·

霍山石斛快速繁殖技術研究

方香香1，謝歡2，伍奧林1，張壽文1*

(1江西中醫藥大學，江西 南昌 330004；2江西中醫藥大學科技學院，江西 南昌 330004)

以霍山石斛種子為外植體進行組織培養，篩選霍山石斛種子萌發、叢生芽增殖及壯苗生根最佳培養基，建立霍山石斛快速繁殖技術體系。結果表明，香蕉汁和土豆汁均能促進霍山石斛種子萌發；叢生芽誘導最佳基本培養基和有機添加物為花寶1號3 g·L-1和土豆汁；香蕉汁和蛋白胨對鮮重、生根數、根長均沒有產生顯著影響，基本培養基只對生根數的影響產生顯著差異，壯苗生根最佳培養基為花寶1號3 g·L-1+MS(大量元素除外)+香蕉200 g·L-1+蛋白胨0.1 g·L-1。

霍山石斛；種子萌發；叢生芽；壯苗生根

霍山石斛俗稱米斛，是蘭科石斛屬的草本植物，含多糖、生物堿、氨基酸等物質，并含鈣、鉀、鈉、鎂、鋅、鐵、錳、硒、銅、鉻、鎳等微量元素，具有抗腫瘤降血壓提高、抗衰老消除疲勞等功效。因自然繁殖率低，分布范圍狹窄，加上具有重要的藥用價值，霍山石斛野生資源被過度采挖而近于滅絕，遠不能滿足市場需求。為了保護和發展這一資源，霍山石斛人工大規模繁殖是必然的發展趨勢。目前運用植物組織培養技術培育試管苗進行人工栽培已成為市場供求主體。本研究旨在研究霍山石斛快速繁殖技術，為霍山石斛的規?；N植優質種苗的獲取提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗的材料為霍山石斛未成熟開裂的蒴果，采自江西省九江市修水縣石斛種植基地，經江西中醫藥大學賴學文教授鑒定為蘭科植物石斛屬霍山石斛的蒴果。

1.2 方法

1.2.1 種子萌發 設計4組不同培養基①MS；②MS+NAA1.0 mg·L-1；③MS+土豆200 g·L-1/L；④MS+香蕉200 g·L-1；考察霍山石斛種子萌發情況。

1.2.2 叢生芽增殖 采用MS、1/2 MS、KC、花寶1號3 g·L-1四種基本培養基，考察基本培養基對對霍山石斛叢生芽增殖的影響；以1/2 MS為基本培養基，分別添加香蕉100 g·L-1、土豆100 g·L-1、水解乳蛋白0.5 g·L-1、酸水解酪蛋白0.5 g·L-1，考察不同添加物對霍山石斛叢生芽增殖的影響。各組培養基中均添加激素6-BA 1.0 mg·L-1、NAA0.5 mg·L-1、KT1.0 mg·L-1[1]。

1.2.3 壯苗生根 選擇基本培養基、香蕉、蛋白胨這三個因素，每個因素三個水平，設計正交試驗，選擇L9(34)正交表第1、2、4列，考察以上3個因素對壯苗生根的影響，因素與水平見表1。各組均添加活性炭0.5 g·L-1。

表1 正交試驗L9(34)因素與水平表

1.2.4 試驗條件與結果統計 以上所有培養基均添加蔗糖20 g·L-1、瓊脂5.6～5.8 g·L-1，PH值6.0左右。各試驗組每組5瓶，每瓶接種試管苗5株，(23±2) ℃，光照時間24 h·d-1，光照強度1200～1600 lx，培養兩個月后統計試驗結果。

叢生芽增殖系數=增殖后總芽數/接種總芽數，鮮重增殖系數=增加鮮重/接種時鮮重

2 結果與分析

2.1 不同培養基對種子萌發的影響

接種兩周后，各試驗組種子開始由米黃色逐漸轉變成黃綠色，1個月后轉為綠色。培養2個月統計萌發率。由表2可以看出霍山石斛種子無菌萌發率很高，香蕉汁和土豆汁有助于提高種子萌發率，NAA對種子萌發的影響不大。各試驗組的種胚萌發形成原球莖之后一定時間內在各組培養基中均能良好生長，但在第3個月時，①和②培養基的原球莖開始逐漸白化，最后全部白化死亡；添加香蕉汁組的原球莖雖然飽滿顏色較深，但在70 d之后原球莖顏色逐漸變淺形成黃綠色，部分白化死亡；添加土豆汁組的原球莖生長最好，不僅飽滿深綠，沒有白化現象，部分還分化出一片鞘葉。

表2 霍山石斛種子萌發試驗結果(n=3)

2.2 基本培養基對叢生芽增殖的影響

由表3可以看出這四種基本培養基對叢生芽增殖的影響有所不同。KC組的增殖系數最大，與其他3組之間存在顯著差異，新生芽長KC組與1/2 MS和MS組之間也存在顯著差異，但是KC基本培養基組小苗部分出現畸形且顏色淺綠，不如其他3組的試管苗長得好?；▽?號3 g·L-1組的叢生芽增殖與新生芽的生長都優于1/2 MS和MS組，試管苗生長狀況良好且有根生成。因此，霍山石斛試管苗叢生芽增殖的適宜基本培養基是花寶1號3 g·L-1。

表3 基本培養基對叢生芽增殖的影響(n=3)

注：表中多重比較相同字母代表差異不顯著

2.3 添加物對叢生芽增殖的影響

表4結果顯示各添加物對叢生芽的誘導沒有明顯的作用，新生芽雖然有所增高，但是增高不是很多。香蕉組試管苗顏色濃綠，較其他組深，部分已經生根，但莖葉細長；酸水解酪蛋白、水解乳蛋白和土豆促使小苗莖葉粗壯，水解乳蛋白還能誘導小苗生根，但土豆組新生芽較其他組都高，因此土豆是霍山石斛叢生芽增殖的最佳添加物。

表4 添加物對叢生芽增殖的影響(n=3)

2.4 基本培養基、香蕉、蛋白胨對壯苗生根的影響

表5結果表明，不同處理組的試管苗生長狀況存在差異，基本培養基、香蕉、蛋白胨對霍山石斛試管苗鮮重、生根數、根長均有不同程度的影響。鮮重增殖系數方差分析表6顯示，各因素對霍山石斛鮮重增殖影響的順序為香蕉>蛋白胨>基本培養基，但均未對鮮重產生顯著影響。根長方差分析表7顯示，各因素對霍山石斛根長影響的順序為香蕉>蛋白胨>基本培養基，3個因素同樣未產生顯著影響。生根數方差分析表8表明，影響霍山石斛生根數順序為基本培養基>香蕉>蛋白胨，香蕉和蛋白胨在本試驗的條件下對生根數未產生顯著影響，但基本培養基對霍山石斛生根數的影響存在顯著差異(P=0.028<0.05)。

表5 霍山石斛壯苗生根L9(33)正交試驗直觀分析(n=3)

本著經濟節約的原則，影響未達到顯著水平的因素選擇成本最少的水平?；九囵B基雖對鮮重增殖和根長未產生顯著影響，但對生根數產生顯著影響，表5中的直觀分析中基本培養基水平2對生根數影響最大，因此基本培養基以水平2為宜。香蕉雖然對3個考察指標的影響均沒有達到顯著水平，但是在試驗過程中發現第7、8、9組的小苗較其他6組小苗高，且水平3對3個考察指標影響最大，因此香蕉汁以水平3為宜。蛋白胨在壯苗生根過程中的促進作用不如香蕉和基本培養這兩個因素，以蛋白胨以水平1為宜?；羯绞鷫衙缟罴雅囵B基為花寶1號3 g·L-1+MS(大量元素除外)+香蕉200 g·L-1+蛋白胨0.1 g·L-1。

表6 鮮重增殖系數方差分析

表7 根長方差分析

表8 生根數方差分析

3 討論

在植物組織培養中常常會添加一些有機添加物，如香蕉汁、土豆汁、椰汁、水解酪蛋白、蛋白胨[6]等[2-6]，這些有機添加物成分比較復雜，大多含氨基酸、激素、酶等一些復雜化合物，對細胞和組織的增殖與分化有明顯的促進作用[7]。本試驗發現土豆汁、香蕉汁對霍山石斛種子萌發形成原球莖具有較好的促進作用，但是香蕉汁對原球莖的生長不利，這與劉道敏等[8]的報道是一致的。香蕉汁與土豆汁對試管苗的生長也有促進作用[9]，但香蕉汁則促進生根效果更明顯，且試管苗葉色濃綠。錢文林[10]、謝寅峰[9]、石瑋[11]等人的研究結果表明，香蕉能很好的促進霍山石斛試管苗生長，增殖鮮重，促進生根，本試驗的結果也驗證了以上結論，但香蕉對鮮重增殖、生根數及根長的影響均未達到顯著水平，可能是水平設計不合理所致。蛋白胨雖然對壯苗生根階段考察的3個指標的影響沒有達到顯著水平，但是試驗中發現，添加蛋白胨組均比沒有添加蛋白胨組試管苗的顏色深、根粗。

叢生芽誘導試驗中增殖系數及新生芽長以KC組最高，MS組最低。許多研究報道表明低濃度的無機鹽更有利于植物的生長[12-13]。KC基本培養基組成比較簡單，礦質元素含量相對較低，使培養基滲透壓降低，更有利于植物吸收養分。但是KC培養基只含有礦質元素，成分簡單，無法滿足植物生長的需要，試管苗逐漸變黃甚至畸形。

霍山石斛規?；a中，試管苗的獲取已不再是難題[14-15]，但是優質的試管苗能夠提高移栽存活率，節約生產成本，提高生產效益。本試驗種子無菌萌發獲得的試管苗經壯苗生根后，葉色濃綠，莖粗根長，在幾種不同組合的基質中移栽兩個月后均能較好生長。

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StudyonRapidPropagationofDendrobiumhuoshanense

FANGXiangxiang1，XIEHuan2，WUAolin1，ZHANGShouwen1*

(1.JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanchang330004； 2.ScienceandTechnologyCollegeofJiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanchang330004)

The seeds ofDendrobiumhuoshanensewere used as explants，and seed germination，culture medium，multiple shoot clumps proliferation seeding roots by tissue culturewas were screened in order to establish a rapid reproduction technology system forD.huoshanense.The results suggested that babana and potato juice could protect seed germination.Hyponex No.1 and potato juice were the optimal basic medium and organic susbstance of multiple shoot clumps proliferation，respectively.Banana juice and peptone had not significant effect on fresh weight，root number and root length.The basic culture medium had significant influence only on the root number.The optimal culture medium of seedling root was 3 g·L-1Hyponex No.1+MS (except for a large number of elements) + 200 g·L-1banana + 0.1 g·L-1peptone.

Dendrobiumhuoshanense；seed germination；multiple shoot clumps proliferation；seeding roots

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.6.003

2014-11-03)

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張壽文，教授，研究方向：中藥資源保護與開發；Tel：(0791)87118994，E-mail：hero220@163.com