豹源貓杯狀病毒ORF2基因的擴增、克隆及原核表達

（吉林農業大學動物科技學院，吉林長春130118）

（吉林農業大學動物科技學院，吉林長春130118）

為制備貓杯狀病毒血清學檢測抗原，本研究根據實驗室保存的1株豹源貓杯狀病毒基因序列設計引物，擴增了開放閱讀框2（ORF2）中1 734 bp的核苷酸序列，將其克隆至表達載體pET-28a上，構建了pET-28a-FCV1734重組質粒。將該質粒轉化大腸桿菌，誘導表達產物經SDS-PAGE和Western blot檢測，證明所表達的蛋白具有良好的反應原性。

貓杯狀病毒；ORF2基因；表達

貓杯狀病毒（Feline calicivirus，FCV）是引起貓及貓科動物口腔和上呼吸道感染的病原，單獨感染常不會引起嚴重的疾病，和其他病原發生混合感染可加重病情[1]。輕者出現口腔潰瘍、牙周炎、結膜炎等癥狀，重者引發肺炎、腸胃炎和跛行等。該病毒最早在1957年被分離得到，全基因序列由Carter M J等測定[2]。FCV引發的貓傳染性鼻-結膜炎呈世界性分布，所有的貓科動物都易感，也有感染狗的報道[3]。近年來，出現了高致死性變異強毒株[4]，在意大利[5]、法國[6]和英國[7]已有報道。

FCV呈二十面體對稱，無囊膜，病毒粒子直徑為30～39 nm。衣殼蛋白由32個暗色的中空杯狀殼粒構成。病毒核酸為單股正鏈RNA，基因組全長約7.8 kb，有3個開放閱讀框（ORF）。ORF1編碼非結構蛋白。ORF2編碼病毒的主要結構蛋白VP1，分為6個區域（A～F），其中C、D、E含有多抗原位點，C和E為可變區域。ORF2先合成75 kDa的前體衣殼蛋白，后經蛋白酶加工切除后，形成62 kDa的衣殼蛋白[8]。ORF3編碼大小約為12 kDa的結構蛋白VP2。不同FCV毒株之間ORF2可變區的差異較大，各毒株間同源性在57%～79%[9]。

本研究根據實驗室保存的1株豹源貓杯狀病毒ORF2比較保守的區域設計了1對引物，擴增獲得了1 734個核苷酸序列，克隆至表達載體pET-28a上，轉化入大腸桿菌進行了表達，并以Western blot檢測了重組蛋白的反應原性，為該病毒血清檢測抗原的制備奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒大腸埃希菌DH5α工程菌、Bl21（DE3）工程菌購自北京全式金公司；質粒pET-28a和含有豹源FCV ORF2基因的質粒均為本實驗室保存和構建。

1.1.2 主要試劑ExTaq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內切酶EcoR I和Xho I購自TaKaRa公司；貓杯狀病毒抗體由本實驗室自制，HRP標記的y羊抗貓二抗購自美國BETHYL公司；Protein Marker質粒小量提取試劑盒購自OMEGA公司，瓊脂糖凝膠購自西班牙BIOWEST公司，瓊脂糖電泳回收試劑盒購自AXYGEN公司，Proten Marker購自北京全式金公司；DAB顯色試劑盒購自北京中杉橋生物公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計及合成根據本實驗室已經完成全基因序列測定的豹源FCV的ORF2序列設計引物，選擇的酶切位點為EocR I/Xho I，擴增目的片段長度為1 734 bp。上游引物序列：CCGGAATTCCGGATGTGCTCAACCTGCGCTAA；下游引物序列：CCGCTCGAGGTTAATGACATAGCCCAATTTTAGTGTG。引物送往生工生物工程上海股份有限公司合成。

1.2.2 目的基因片段的擴增以本實驗室保存的含有豹源FCV ORF2的質粒為模版，用高保真ExTaq DNA聚合酶進行目的基因的擴增。擴增體系為：模板2 μL、dNTPs 2 μL，PCR緩沖液2.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ExTaq DNA聚合酶0.3 μL，雙蒸餾水17.2 μL。反應條件：95℃預變性5 min， 94℃變性30 s，退火溫度60℃30 s，72℃延伸1.5 min，共35個循環，72℃最終延伸10 min。反應結束后，將PCR產物于1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.3 目的基因片段和質粒的酶切及回收將擴增的目的片段回收后，利用EocR I和Xho I分別進行單酶切，再對pET-28a質粒進行EocR I和Xho I酶切。酶切體系為：EcoR I酶1 μL，10×H緩沖液1 μL，PCR產物4 μL，水4 μL，37℃作用4 h，小牛腸堿性磷酸酶（CIAP）0.2 μL/管，37℃作用1 h。按照AXYGEN膠回收試劑盒說明書回收酶切產物。

1.2.4 重組質粒pET-28a-FCV1734的構建及鑒定將經酶切的目的片段和pET-28a質粒用T4 DNA連接酶連接過夜，轉化到DH5α工程菌中，37℃培養過夜；挑取單個菌落，涂布于50 μg/mL卡納霉素的LB培養基中，震蕩培養，按照OMEGA質粒提取試劑盒提取質粒。以EocR I和Xho I酶切鑒定重組質粒，將陽性質粒送上海生工生物公司測序。

1.2.5 外源基因的表達及Western blot分析將含有重組質粒pET-28a-FCV1734的大腸桿菌接種于含卡那霉素（50 μg/mL）的液體LB培養基中，37℃180 r/min培養過夜；次日以1%（W/W）的濃度接種相同LB培養基，37℃180 r/min搖菌培養，當菌液OD600值達0.6～0.8時，加入IPTG（終濃度為0.8 mmol/L）在25℃條件下誘導6～8 h；取誘導菌10 000 r/min離心2 min，棄去上清，加入50 mL PBS將菌重懸，10 000 r/min離心2 min，重復2次。將重組菌在冰浴上超聲破碎7 min，間隔3～5 s；7 000 r/min離心15 min，分別取上清和沉淀加入4倍上樣緩沖液，煮沸后進行SDS-PAGE（濃縮膠為5%，分離膠為15%）分析。同時設pET-28a空載體做對照，經考馬斯亮藍染色觀察結果。常規方法進行電轉移，4℃5%脫脂奶粉封閉過夜，TBST洗滌3次，每次5 min；FCV陽性血清37℃60 r/min搖床孵育1 h，同上方法洗滌；HRP標記羊抗貓IgG，37℃60 r/min搖床孵育1 h，洗滌同上。中山金橋DAB試劑盒顯色分析。

2 結果和分析

2.1 目的基因片段的擴增以本實驗室保存的含有豹源FCV ORF2的質粒為模版，進行PCR擴增，于1%的瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖1所示，在1 734 bp處出現與預期大小相符的目的條帶。

圖1 PCR結果Fig.1 The result of PCR

2.2 重組質粒pET-28a-FCV1734的構建及鑒定將連接產物轉化到大腸埃希菌DH5α工程菌，提取質粒后進行EcoR I和Xho I雙酶切鑒定，酶切后于1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切，結果如圖2所示，分別在5 000 bp和1 734 bp出現與預期大小相同的核苷酸條帶。由此證明，FCV 1734核苷酸片段成功連入pET-28a表達載體中?；驕y序結果與已知序列完全一致。

圖2 重組質粒pET-28a-FCV1734的酶切鑒定Fig.2 Identification of the recombinant plasmid pET-28a-FCV1734 by enzyme

2.3 外源基因的表達及鑒定經IPTG誘導，重組菌超聲破碎，SDS-PAGE電泳結果如圖3，從圖3中可見，在70 kDa出現的目的蛋白，與預期蛋白大小相符合。

圖3 SDS-PAGE結果Fig.3 The result of SDS-PAGE

以常規方法進行電轉、封閉、FCV陽性血清、二抗孵育后，DAB試劑盒顯色結果如圖5，在70 kDa處有特異性條帶，證明表達的蛋白能夠與FCV的陽性血清、HRP羊抗貓IgG酶標二抗反應。由此說明，表達產物具有良好的反應原性。

圖4 Western blot結果Fig.4 The result of Western blot

3 討論

FCV ORF2編碼的衣殼蛋白由A～F 6個區域構成，其中，C、D和E區含有多個抗原表位，其相對比較保守，且與病毒的進化關系密切[10]。此外，在ORF2基因上存在起始密碼子和終止密碼子，其中的1 734 bp的基因序列中含有ORF2的所有抗原表位，因此，本試驗選擇了該段序列進行了擴增、克隆、表達和活性分析以制備FCV血清學檢測用抗原。

由FCV引起的貓傳染性鼻結膜炎在臨床癥狀上與由貓皰疹病毒1型引起的貓傳染性鼻氣管炎難以區別，且常和其他病原混合感染，給該病的臨床診斷帶來困難[11]。因此，建立病原學和血清鑒別診斷方法有實際意義。Martella V等[12-14]建立了對FCV檢測的普通PCR方法，姜雪等[15]建立了熒光定量PCR檢測方法，均可以用于該病的確診。Robert C.H.Lau等[16]建立了FCV間接ELISA方法，用來評估貓杯狀病毒減毒疫苗的免疫原性；Merial[17]利用間接ELISA方法檢測貓傳染性鼻氣管炎病毒、貓細小病毒和FCV抗體。目前，國內尚無檢測FCV的血清學商品試劑盒。本研究利用本實驗室分離得到的1株豹源FCV，依據已知的基因序列設計了引物，成功克隆到表達載體pET-28a上，獲得了重組表達質粒pET-28a-FCV1734并進行了原核表達，表達的蛋白經Western blot檢測表明具有良好的反應原性。本試驗結果為FCV血清學檢測抗原的制備奠定了基礎。目前，筆者以該重組抗原初步建立了FCV間接ELISA方法，正在開展我國貓傳染性鼻結膜炎的血清學調查研究。

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（編輯：張婷婷）

豹源貓杯狀病毒ORF2基因的擴增、克隆及原核表達

劉秋艷，應瑛，王一鳴，陳小慶，趙艷麗，胡桂學?

Amplification,Clone and Prokaryotic Expression of ORF2 Gene of Feline Calicivirus Isolated from Leopard

Liu Qiuyan,Ying Ying,Wang Yiming,Chen Xiaoqing,Zhao Yanli,Hu Guixue

(College of Animal Science and Technology,Jilin Agricultural University,JilinChangchun130118)

In order to prepare the antigen for serological detection of Feline calicivirus,the primers were designed in according to the gene sequence of 1 FCV isolated from a leopard preserved in our laboratory.The 1 734 nucleotides in open reading frame 2(ORF2)were amplified and cloned into expression vector pET-28a to construct recombinant plasmid named pET-28a-FCV1 734.The recombinant plasmid was transformed into E.coli.The expression product induced by IPTG was determined by SDS-PAGE and Western blot.The result proved that the expressed protein had good reactogenicity.

Feline calicivirus;ORF2 gene;Expression

S852.65文獻標識碼：B文章編號：1672-9692(2015)01-0001-04

2015-01-12

劉秋艷（1989-），女，在讀碩士，研究方向為動物病毒學。

胡桂學（1963-），男，教授，博士研究生導師，研究方向為動物病毒學。

公益性行業（農業）科研專項（201303042）