一例豬圓環病毒2型與豬肺炎支原體混合感染的診斷

（遼寧省營口市動物疫病預防控制中心，遼寧營口115000）

（遼寧省營口市動物疫病預防控制中心，遼寧營口115000）

遼寧營口某豬場發生豬消瘦、呼吸系統疾病甚至死亡的疫情。采集病料提取病變組織總DNA或RNA進行豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環病毒2型、豬細小病毒、豬偽狂犬病病毒、豬瘟病毒、豬肺炎支原體的PCR或RT-PCR檢測。PCR擴增出353 bp的豬圓環病毒2型特異性條帶和670 bp的豬支原體肺炎特異性條帶。診斷為豬圓環病毒2型和豬肺炎支原體混合感染。

豬圈環病毒2型；豬肺炎支原體；混合感染；PCR；診斷

2013年12月，遼寧省營口市某豬場部分斷奶豬和育肥豬生長緩慢、體溫升高、呼吸困難、消瘦等主要特征的傳染病。具體癥狀為精神沉郁，體溫為40～41℃，雙耳及四肢末端發紺，妊娠母豬流產，仔豬呼吸困難，育肥豬清晨和傍晚出現咳嗽現象，眼結膜炎，眼瞼水腫，有呼吸道癥狀，后軀無力，共濟失調。新生仔豬發生死亡，伴有嘔吐、腹瀉及發抖，震顫和運動失調等神經癥狀。根據癥狀，初步懷疑為豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環病毒2型（PCV2）、豬細小病毒（PPV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬肺炎支原體（Mhp）一種或者幾種混合感染。

采集病死豬及病危豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等病料進行豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環病毒2型（PCV2）、豬細小病毒（PPV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬肺炎支原體（Mhp）的PCR或RT-PCR檢測。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集遼寧省營口市某養豬場送檢豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、血清等病料共10份。

1.2 培養基TSA固體培養基，含5%小牛血清和0.5%NAD。

1.3 主要酶和試劑RNA反轉錄酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠電泳染色劑Goldview購自賽百盛生物公司；蛋白酶K、SDS、Trizol試劑購自欣經科化學試劑公司；苯酚、氯仿、異戊醇及常用化學試劑購自北京市化學試劑公司；生化鑒定試劑盒購白杭州天和微生物試劑有限公司；管式液體樣品病毒DNAout試劑盒購自TIANDZ公司。

1.4 引物參考岳豐雄設計引物[1（]見表1），引物由上海Invitrogen合成，用高壓滅菌ddH2O溶解配成10 pmol/L，-20℃保存備用。

表1 引物設計Table1 Primer Design

1. 5PRRSV和CSFV的RT-PCR檢測

1.5.1 病毒總RNA的提取病毒總RNA的提取按Trizol試劑使用說明書提取樣品總RNA進行，室溫自然干燥，加入適量DEPC處理過的水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后，-20℃保存備用。

1.5.2 RT-PCR反轉錄反應按Promega公司的使用說明書進行：取總RNA 7μL，加入20 μL反轉錄體系中，包括4 μL反轉錄溶液（50 mmol/L，pH 8.3 Tris-HCl。75 mmol/L KCl，3 mmol/L MgCl2，10 mmol/I DTT），6 μL dNTPs，1 μL OligodT引物（50 pmol/L），1 μL M-MLV反轉錄酶（200 U/ μL）和1 μL RNase Inhibitor（40 U/μL），用DEPC水補至20 μL，42℃水浴1 h，70℃10 min，置-20℃備用。PCR反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，58.6℃（PRRSV）或55.6℃（CSFV）退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環；72℃延伸7 min。取5 μL PCR擴增產物于1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定[2]。

1.6 PCV2和PRV的PCR檢測

1.6.1 病毒總DNA的提取采用酚氯仿抽提法提取病料中的DNA，室溫干燥，加入20μL滅菌ddH2O，-20℃保存備用。

1.6.2 PCV2和PRV的PCR擴增PCR反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，58.6℃（PCV2）、55℃（PPV）、61℃（PRV）退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環；72℃延伸7 min。取5 μL PCR擴增產物于l%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定[3]。

1.6.3 Mhp基因組的提取按TIANDZ公司柱式細菌DNAout試劑盒說明書進行。-20℃備用。

PCR反應體系（50 μL）如下：TaKaRa Taq（5 U/ μL）25 μL；10xPCR Buffer（Mg2+Plus）5 μL；dNTP Mixture（各2.5 mM）4 μL；Mhp基因組溶液5 μL；DDW加至50 μL?；靹蚝蠓湃隤CR自動擴增儀中進行擴增，擴增程序為：95℃預變性3 min；95℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30個循環：72℃延伸7 min[4]。

2 結果與分析

PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖見圖1。

圖1 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of.PCR products

PCR或RT-PCR檢測結果表明，PCV2擴增為陽性，片段大小約353 bp；Mhp擴增為陽性，片段大小為670 bp；均與預期相符，其他病毒檢測結果均為陰性。

3 討論

通過對豬場進行流行病學調查，并且結合對病死豬的臨床癥狀及剖檢變化進行觀察和實驗室診斷，最終確診此次豬場發生的疾病為豬圓環病毒2型和豬支原體肺炎的混合感染。豬圓環病毒2型是斷奶仔豬多系統衰竭綜合征的主要病原[5]。各種年齡、不同性別的豬都可以感染，但以哺乳期和育成期的豬最易感，病死率可達10%[6]。豬圓環病毒2型及其相關疾病已在全世界范圍內發生與流行，它屬于一種免疫抑制性疾病[7]，PCV-2主要侵害機體的免疫系統，單核細胞和巨噬細胞是PCV-2的靶細胞，可以造成機體的免疫抑制[8-9]。

豬支原體肺炎屬于豬的一種高發慢性呼吸道傳染病，主要癥狀為氣喘，主要病理變化為肺臟的肉變、胰變，病變呈對稱性分布。此病在畜牧業發達的國家普遍流行，同時也廣泛存在于世界各國，在我國也屬養豬業的主要接觸性傳染病之一。如若診治不及時甚至可能造成死亡，也可繼發其他病原體感染，包括豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環病毒2型（PCV2）、偽狂犬病毒（ADV）以及豬流感病毒（SIV）。多病原混合感染導致產生所謂的豬呼吸系統疾病綜合征（porcine respiratorydisease complex，PRDC）[10]。本病例可能為圓環病毒2型引發豬免疫能力下降，導致繼發豬支原體肺炎。

PCR擴增是一種快速、特異、易于操作、廣泛應用于實驗室的檢測方法。本次發病在臨床初步診斷的基礎上，采用PCR方法進行了實驗室診斷，從而確定有豬圓環病毒2型和豬肺炎支原體感染，確診為豬圓環病毒2型、豬肺炎支原體混合感染。

針對該病例的診斷，豬場應該加強管理，及時隔離病患豬只，阻斷疾病蔓延，改善飼養條件，提高豬只的免疫力，飼養技術專業化，盡量做到自繁自養，合理用藥，不濫用抗生素，建立準入和淘汰制度，維護健康豬群[11]。

[1]岳豐雄.鑒別PCV2、PPV、PRV、PRRSV、CSFV多重PCR診斷方法的建立及初步應用[D].烏魯木齊：新疆農業大學，2008.

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[6]Pallares C,Neumann G,Grutze I,et a1.Case report:Porcine circovirus type 2 infection in an European wild boar[J].Vet Res,2004, 35(2):243 253.

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[9]陳溥言.獸醫傳染病學[M].5版.北京：中國農業出版社，2007：231-234.

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[11]趙東升，劉有昌，李祥健，等.豬肺炎支原體與其他病原的相互作用[J].養豬，2008，（5）：66-68.

（編輯：張婷婷）

一例豬圓環病毒2型與豬肺炎支原體混合感染的診斷

谷建

Diagnosis of mixed infection of porcine circovirus 2 and mycoplasma hyopneumoniae

Gu Jian

（Yingkou city animal disease prevention and control center,LiaoningYingkou115000）

A pig farm in Yingkou broke out disease which caused swine weight loss,disease of respiratory system,even death.Samples of diseased pigs were collected.Total DNA and RNA of the sampleswereextracted.Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV),porcine circovirus type 2(PCV2),classic swine fever virus(CSFV),pseudorabies virus(PRV),porcine parvovirus(PPV)and mycoplasma hyopneumoniae(Mhp),were detected by PCR or RT-PCR.A 353 bp production which correspond to porcine circovirus type 2 was amplified and a 670 bp production which correspond to mycoplasma hyopneumoniae was amplified.Finally,the diagnosis was a mixed infection of PCV2 with MHP.

Porcine circovirus type 2;Mycoplasma hyopneumoniae;Mixed infection;PCR;Diagnosis

S858.28文獻標識碼：A文章編號：1672-9692(2015)01-0040-04

2014-11-24

谷建（1983-），男，獸醫師，碩士，主要從事動物疫病防控與檢測工作。

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