兩種糞腸球菌的分離方法比較

（1.遼寧省獸藥飼料畜產品質量安全檢測中心，遼寧沈陽110016；2.遼寧成大生物股份有限公司，遼寧沈陽110179）

（1.遼寧省獸藥飼料畜產品質量安全檢測中心，遼寧沈陽110016；2.遼寧成大生物股份有限公司，遼寧沈陽110179）

本研究利用采集的雞泄殖腔和豬肛門拭子樣本400份，采用兩種方法分離糞腸球菌并進行對比。結果顯示，兩種方法對4類樣品中糞腸球菌的分離率分別為22%、33%、23%、22%（方法Ⅰ）和86%、91%、87%、82%（方法Ⅱ），說明建立了準確、高效、可靠的糞腸球菌分離方法。

糞腸球菌；分離純化；方法比較

腸球菌屬于1984年從鏈球菌屬中分離出來成為獨立的新菌屬[1-2]，現根據DNA同源性，將其列為腸球菌屬，屬腸（見獸醫微生物學第五版第90頁）球菌科。腸球菌在自然界分布廣泛，是水、空氣、塵埃、人及動物糞便以及健康上呼吸道的常在菌，糞腸球菌和屎腸球菌是引起醫院內感染的主要腸球菌種[3]，已經成為醫院內感染的第二大病原[4-6]，但在動物醫學領域，對該病原的研究很少[7-9]。美國食品藥品監察管理局（FDA）、疾病預防控制中心（CDC）和美國農業部（USDA）共同組成一個全國性的監測網絡，監測選定的動物腸道病原菌和動物、零售肉類和人的共生生物對在人醫和獸醫中有重要意義的抗菌素的耐藥性的變化情況[10]，該部門從2003年開始監測糞腸球菌的耐藥變化情況。我國獸醫系統也建立了全國動物源細菌耐藥性監測網絡，建設了國家獸藥安全評價實驗室體系[11]，2013年起把糞腸球菌作為重點監測目標菌株。本文通過比較傳統方法與本實驗室自建的分離鑒定方法，對動物源糞腸球菌進行分離和鑒定，摸索出適合實際工作應用的糞腸球菌的一套快速、準確、可靠的分離鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 菌株及待分離材料來源質控菌株為ATCC29212，購自中國獸藥監察所；待分離材料采自養殖場（戶）。

1.2 儀器生物安全柜CLASSⅡ（美國NUAIRE公司）；全自動高壓滅菌器（日本三洋電器集團）；ABT Expression鑒定儀（BIOMERIEUX公司）。

1.3 培養基與材料運送培養基、腸球菌顯色培養基、腸球菌肉湯培養基、哥倫比亞血瓊脂、革蘭氏染色液購自北京陸橋技術有限責任公司；糞腸球菌瓊脂培養基購自青島高科園海博生物技術有限公司；API NaCl 0.85%培養基、ID32E鑒定條均購自BIOMERIEUX公司。

1.4 方法

1.4.1 采樣用滅菌棉簽采集動物肛門和泄殖腔樣品，置于運送培養基中0～4℃保存。

1.4.2 分離純化方法Ⅰ取拭子樣品直接接種于糞腸球菌瓊脂平面，36±1℃培養48 h。挑取糞腸球菌可疑菌落，接種于腸球菌顯色培養基36±1℃培養48 h。將疑似菌株接種于哥倫比亞血瓊脂上36± 1℃培養24 h，備用。

1.4.3 分離純化方法Ⅱ將拭子樣品直接放入腸球菌肉湯中，36±1℃培養24 h。挑取預增菌培養物劃線接種于糞腸球菌瓊脂培養基36±1℃培養48 h。將疑似菌株接種于哥倫比亞血瓊脂上36± 1℃培養24 h，備用。

1.4.4 形態學鑒定挑取肉湯培養物及平板上單菌落分別作革蘭氏染色，光學顯微鏡下觀察細菌形態和染色特征。

1.4.5 生化鑒定將上述獲得的疑似單菌落，在哥倫比亞血瓊脂平板上劃線純化培養不超過24 h。將待檢細菌單個菌落，懸浮于3 mL懸浮培養基，制備4.0麥氏濃度的菌懸液，使用自動加樣器將菌懸液滴入試紙條反應杯中，每個反應杯中滴入55 μL，菌液和試劑滴加完畢后，37℃培養4 h，用細菌鑒定儀判讀。

2 結果與分析

2.1 分離純化結果糞腸球菌瓊脂培養基上帶棕色環的棕黑色菌落，邊緣光滑無白色潤圈的為疑似單菌落，白色菌落為其他菌株，結果見圖1～圖2。

圖1 陽性糞腸球菌在糞腸球菌瓊脂培養基上的生長形態Fig.1 Positive Enterococcus faecalis growth morphology on Enterococcus faecalis agar medium

圖2 陰性對照菌株在糞腸球菌瓊脂培養基上的生長形態Fig.2 Negative control strains growth morphology on Enterococcus faecalis agar medium

挑取疑似菌株接種于腸球菌顯色培養基培養，紅色至紫紅色的可疑菌落可進一步確定為糞腸球菌，結果見圖3。

圖3 糞腸球菌在腸球菌顯色培養基上生長狀態Fig.3 Enterococcus faecalis growth morphology on Enterococcus chromogenic medium

在腸球菌肉湯中，培養后混濁變黑為疑似糞腸球菌；仍保持澄清透明、棕褐色為陰性，具體結果見圖4。

圖4 腸球菌肉湯中的生長情況Fig.4 Enterococcus broth growth situation

最終在哥倫比亞血瓊脂上菌落圓形、純白色，表面凸起濕潤、有光澤、邊緣整齊的菌落確定為陽性糞腸球菌，結果見圖5。

圖5 糞腸球菌在哥倫比亞血瓊脂上的生長狀態Fig.5 Enterococcus faecalis growth morphology on Columbia blood agar medium

2.2 鑒定結果檢測菌株均為革蘭氏陽性菌，細菌呈現圓形或卵圓形，在固體培養基上單個、成對或呈鏈狀排列，鏈的長短不一、形狀各異。兩種分離純化方法得到的疑似菌株經細菌鑒定儀判讀后得到的陽性糞腸球菌生化鑒定結果，見表1。

表1 糞腸球菌生化鑒定檢驗報告單Table1 Enterococcus faecalis biochemical identification inspection report

2.3 兩種方法分離率比較通過以上兩種試驗方法的比較，發現方法Ⅱ的分離率在80%以上，在不同物種不同養殖場分離率都高于方法Ⅰ，具體數據見表2～表3，該方法實用性強，便于推廣使用。

表2 兩種糞腸球菌分離方法比較Table2 Comparison of two kinds of Enterococcus faecalis separation method

表3 兩種分離鑒定糞腸球菌方法比較Table3 Comparison of two kinds of Enterococcus faecalis isolation and identification method

3 討論

本實驗室建立的分離純化方法Ⅱ，經過3步的分離純化，糞腸球菌的分離率可達80%～90%，用生化鑒定證明了該方法的陽性率高達98%以上，在實際應用中可省略生化鑒定步驟，作為高效的糞腸球菌篩選方法；而傳統的分離純化方法Ⅰ只有通過生化鑒定最終才能確定是否是陽性菌株，分離效果難以掌控。比較方法Ⅰ和方法Ⅱ詳見表3。因此，方法Ⅱ更適用于實際糞腸球菌的分離鑒定。

比較兩種方法區別主要是在第一步使用的培養基不同，分別是糞腸球菌瓊脂和腸球菌肉湯。糞腸球菌瓊脂使用的是平板，腸球菌肉湯使用的是液體培養基，棉簽浸浴在肉湯中更利于糞腸球菌的增殖。糞腸球菌瓊脂培養基中的月示胨和酵母浸粉提供氮源、維生素、氨基酸和碳源；乳糖是大腸菌群可發酵的糖類；疊氮化鈉可抑制革蘭陰性菌；溴甲酚紫和TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）作為指示劑；瓊脂是培養基的凝固劑。腸球菌肉湯培養基中的胰酪蛋白胨和牛肉浸粉、酵母粉提供氮源、維生素和生長因子；氯化鈉維持均衡的滲透壓；細菌水解七葉苷與檸檬酸鐵銨中鐵離子反應形成黑色的6,7-二羥基香豆素；檸檬酸鈉、牛膽粉和疊氮化鈉為選擇性抑菌劑，抑制非鏈球菌的細菌。根據兩種培養基的成分和相應的作用，方法Ⅱ中使用的的抑制非鏈球菌的抑制劑較方法Ⅰ多，從多種途徑抑制雜菌的生長，從而達到了良好的分離效果。

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[11]趙曉彤，周鐵忠，李欣南.我國動物源細菌耐藥性監測現狀與耐藥性控制策略分析[J].現代畜牧獸醫，2013，12：45-48.

（編輯：張婷婷）

兩種糞腸球菌的分離方法比較

韓鐫竹1，李欣南1?，蘇葳藝1，楊文腰2

The comparison between two methods to separation and purification of enterococcus faecalis

Han Juanzhu1,Li Xinnan1*,Su Weiyi1,Yang Wenyao2

(1.Liaoning Testing&Inspection Center for Quality&Safety of Veterinary Drugs,Feed and Livestock Products, LiaoningShenyang110016; 2.Liaoning Chengda Company Limited,LiaoningShenyang110179)

400 swab samples collected from chicken cloaca and pig anus were used to compare two methods to separation and purification of enterococcus faecalis.The separation rates of the two methods were 22%、33%、23%、22%(MethodⅠ)and 86%、91%、87%、82%(MethodⅡ).Thus the accurate,fast and reliable method of separation wasestablished.

Enterococcus;Separation and purification;Method comparison

S858.23文獻標識碼：B文章編號：1672-9692(2015)01-0005-05

2014-11-25

韓鐫竹（1985-），女，碩士研究生，主要從事動物源細菌耐藥方面工作。

李欣南（1978-），女，博士，主要從事動物源細菌耐藥性、微生態制劑、生鮮乳質量安全評價等方面工作。

948課題“獸藥監管技術引進”項目編號2011-G14（4）