雙菌發酵黃漿水制備豆腐凝固劑培養條件優化

呂　博，黎晨晨，劉　寧，李　?。ü枮I商業大學食品工程學院，黑龍江省高校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱150076）

雙菌發酵黃漿水制備豆腐凝固劑培養條件優化

呂博，黎晨晨，劉寧，李健*
（哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江省高校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱150076）

以豆腐黃漿水為原料，經保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發酵制備豆腐凝固劑。研究了黃漿水初始pH、乳糖添加量、發酵時間、培養溫度、接種量等因素對乳酸菌產酸量的影響，在此基礎上采用正交實驗優化培養基碳源及發酵條件。實驗結果表明最佳的凝固劑培養條件為：黃漿水中乳糖添加量1.5%、黃漿水初始pH=6.5、接種量6%、培養溫度37℃、發酵時間84h的條件下乳酸量為5.1g/L。在此工藝條件下豆腐出品率為196.43%，硬度為419.15g，黏聚性為261.42gs，蛋白質含量9.62%。與其他方法相比，方法具有提高凝固劑中乳酸含量，改善豆腐凝固劑功能性，同時提高了豆腐中蛋白質含量。

豆腐黃漿水，保加利亞乳桿菌，嗜熱鏈球菌，有機酸凝固劑，發酵

豆腐黃漿水是豆腐生產過程中的副產物之一［1-2］，其中含有蛋白質、糖，大豆異黃酮，鉀、鈉，維生素等多種營養成分［3-4］，隨著豆腐行業的發展，黃漿水作為其副產物，其處理問題日益受到關注［5-6］。

豆腐凝固劑是豆腐制作過程中的重要添加劑之一［7］。有機酸類豆腐凝固劑是以降低豆漿溶液的pH使其接近蛋白質的等電點的方法，達到沉降蛋白質的目的。酸漿作為豆腐凝固劑有著悠久的歷史，由于酸漿需自然發酵后才可作為凝固劑點豆腐，并且漿循環使用，存在潛在的安全衛生問題。宋蓮軍等［8］將乳酸、乙酸等有機酸按照一定比例混合制成復合豆腐凝固劑，彌補了單一凝固劑制得豆腐在彈性、硬度方面的不足，但是口味稍酸，風味欠佳。喬明武等［9］用響應曲面法優化發酵條件制備凝固劑，發酵時間短，但接種量和乳糖添加量較大。王璐等［10］利用山楂、五味子、燈籠果等藥食兩用食品，通過超聲輔助水浴法提取總酸，制得天然新型豆腐凝固劑，消除了化學合成酸性凝固劑對人體的不利影響，但制成的豆腐不硬挺。

常用的豆腐凝固劑為石膏、鹽鹵、葡萄糖-δ-內脂。利用微生物發酵制備豆腐凝固劑的研究還不是非常全面。保加利亞乳桿菌（Str.Thermophilic）和嗜熱鏈球菌（Lb.Bulgaricus）存在共生關系，兩者混合發酵能提高產酸速度，減弱后酸化程度，促進風味物質產生，并能調節人體腸道菌群［11-13］。因此本實驗以豆腐黃漿水為原料，采用正交實驗優化方法探討保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌共同發酵制備新型的有機酸豆腐凝固劑，以期提高黃漿水中乳酸含量并賦予其特有的乳香味，減少處理副產物的工序和成本，提高資源利用率，為新型豆腐凝固劑的研制提供基礎數據。

1　材料與方法

1.1材料與設備

乳酸菌哈爾濱商業大學食品學院農產品實驗室提供；黃漿水李氏豆腐坊；NaOH（分析純） 天津市大陸化學試劑廠；酚酞天津市天新精細化工開發中心；乳糖（食品級） 武漢萬榮科技發展有限公司；葡萄糖（分析純） 天津市致遠化學試劑有限公司；DNS（3，5-二硝基水楊酸）（分析純） 北京篤信精細制劑廠；鹽酸（分析純） 丹東市龍海試劑廠；檸檬酸（食品級） 濟南歷下雅軒化工產品經營部；硫酸銅（分析純）天津市勱特吉爾環保技術研究所；硫酸鉀（分析純） 天津市天力化學試劑有限公司；碳酸鈉（食品級） 天津市鑫大宇化工有限公司。

DHP-9032型電熱恒溫培養箱、DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱上海一恒科學儀器有限公司；LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫療器械廠；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺蘇州凈化設備有限公司；721E型可見分光光度計上海光譜儀器有限公司；pHS-25數顯pH計上海精密科學儀器有限公司；ALC-110.4型電子天平北京賽多利斯儀器系統有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1黃漿水中還原糖含量采用DNS比色法測定黃漿水中還原糖含量［14］。

1.2.2黃漿水和豆腐中粗蛋白含量采用GB/T 5511-2008《谷物和豆類氮含量測定和粗蛋白含量計算凱氏法》［15］進行測定。

1.2.3菌種的活化牛乳在121℃條件下滅菌20min，取菌種后，接種于15mL牛奶中，在37℃下活化24h，取1mL再接種到15mL牛奶中，在37℃下活化24h，如此反復活化3～4次后，作為種子菌種備用［16-17］。

1.2.4乳酸菌的擴大培養取5mL待發酵的黃漿水與10mL試管中，121℃，滅菌20min。冷卻后接入3環菌種，于37℃條件下培養24h，為一級擴大培養液。取一級擴大培養液3環，轉入盛有100mL已滅菌的黃漿水的250mL三角瓶中，放入37℃培養箱中靜置培養24h后備用［18］。

1.2.5產乳酸量的測定用0.1000mol/L NaOH溶液滴定發酵前后黃漿水，計算乳酸菌產乳酸量計算公式如式（1）所示

式中：C2—乳酸菌產乳酸量，g/L；C1—NaOH溶液濃度，mol/L；M—乳酸摩爾質量，g/mol；V1—NaOH滴定發酵液消耗的體積，mL；V2—NaOH滴定原始黃漿水消耗的體積，mL；V3—待測發酵液體積，mL。

1.2.6單因素實驗考察乳糖添加量、黃漿水初始pH、乳酸菌接種量、培養溫度和發酵時間5種因素對乳酸菌產酸量的影響。

1.2.6.1乳糖添加量對產酸量的影響在黃漿水中分別添加0%、1%、2%、3%、4%的乳糖，通過葡萄糖標準曲線確定相應的還原糖含量，黃漿水初始pH=6.0，將乳酸菌以4%的接種量接種于黃漿水中，37℃條件下培養60h后，按1.2.5測定產乳酸量，進而確定乳糖添加量。

1.2.6.2黃漿水初始pH對產酸量的影響在黃漿水中添加2%的乳糖，用NaOH和檸檬酸調pH分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5進行實驗，將活化后的乳酸菌以4%接種量接種于不同pH的黃漿水中，在37℃條件下培養48h。按1.2.5測定產乳酸量，進而確定黃漿水初始pH。

1.2.6.3乳酸菌接種量對產酸量的影響在黃漿水中添加2%的乳糖，調節pH=6.0，乳酸菌接種量分別為2%、4%、6%、8%、10%接種于黃漿水中，在37℃條件下培養48h。按1.2.5測定產乳酸量，進而確定最適接種量。

1.2.6.4培養溫度對產酸量的影響在黃漿水中添加2%的乳糖，調節pH=6.0，乳酸菌以6%的接種量接種于黃漿水中，分別在29、33、37、41、45℃條件下培養48h。按1.2.5測定產乳酸量，進而確定最適培養溫度。

1.2.6.5發酵時間對產酸量的影響在黃漿水中添加2%的乳糖，調節pH=6.0，乳酸菌以6%的接種量接種于黃漿水中，在37℃條件下分別培養48、60、72、84、96h。按1.2.5測定產乳酸量，進而確定培養時間。

1.2.7正交實驗設計根據上述單因素實驗，設計五因素四水平正交實驗［19-21］，確定保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌共同發酵產酸的最優培養基及發酵條件。實驗選取的因素及水平見表1。為驗證正交實驗最佳培養條件下的菌株產酸量，做三組平行實驗進行復證。

1.2.8采用最優組合制作的豆腐理化指標測定利用質構儀對豆腐黏聚性及硬度進行測定。采用TPA模式。測定參數為：探頭型號是P50，測試前速度為2mm/s，測試速度為1mm/s，測試后速度為1mm/s，壓縮形變量是30%，觸發力為5g，同一樣品選擇5個不同的部位測定，取平均值［22］。豆腐出品率是每100g干豆所得成品豆腐的重量。將制得的豆腐樣品稱量出質量，根據式（2）計算出豆腐出品率［10］。

表1　L16（45）正交實驗因素水平表Table 1　FactorsandlevelsoforthogonalexperimentdesignL16（45）

式中：F—豆腐出品率，%；m豆腐—成品豆腐質量；

m干豆—干豆的質量。

1.2.9數據處理通過Excel做出不同影響因素對乳酸量影響的曲線，并通過SPSS軟件對正交實驗結果進行方差分析（顯著水平為0.05），確定各影響因素的主次順序及最佳優化條件。

2　結果與討論

2.1黃漿水中還原糖、粗蛋白含量的測定

實驗所得的標準曲線為：y=0.2969x-0.0091，R2= 0.9969。黃漿水中還原糖通過標準曲線計算出相應含量為0.580g/100mL。

按GB/T 5511-2008對豆腐黃漿水中粗蛋白含量進行測定，結果為0.34%。

2.2單因素實驗

2.2.1乳糖添加量對菌株產酸量的影響保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌在不同乳糖添加量的黃漿水中發酵產乳酸，通過測定發酵前后NaOH消耗的體積，確定黃漿水中不同乳糖添加量對乳酸菌產酸量的影響，結果如圖1所示。

圖1　不同乳糖添加量對乳酸菌產酸的影響Fig.1　Lactose added effect on acid production

乳糖為乳酸菌代謝的提供碳源，能延長穩定期，隨著乳糖含量的增加，使乳酸菌進入穩定期后代謝產物積累和生化反應仍繼續進行，降低菌體死亡率。分析圖1曲線趨勢，乳糖添加量在0%～2%時，乳酸菌產乳酸量呈上升趨勢，在0%～1%時產乳酸量變化顯著（p≤0.05），在1%～2%時變化不顯著。在2%～4%范圍內乳酸量變化不顯著。當添加量為2%時乳酸含量達到最大，隨著乳糖含量的增加乳酸量逐漸減少。從吸光值A可知，隨著乳糖濃度的增大A值先升高后降低，A值最大為0.77時乳酸量最大，即乳酸添加量為2%時達到最大，出現此情況是因為培養基中碳氮比改變，改變微生物細胞滲透壓，不適合菌株的生長及代謝產物的積累。并且由于乳糖添加量越高發酵液越渾濁，作為豆腐凝固劑點豆腐會影響豆腐的外觀顏色。所以，選擇乳糖添加量在2%左右進行正交實驗。

2.2.2黃漿水初始pH對菌株產酸量的影響保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌在不同初始pH黃漿水中發酵產乳酸，通過測定發酵前后NaOH消耗的體積，確定不同初始pH環境下的產酸量，結果如圖2所示。

圖2　不同初始pH對乳酸菌產酸的影響Fig.2　Initial pH effect on acid production

由圖2曲線趨勢知，初始pH在4.5～5.5時，乳酸量呈顯著增加趨勢（p≤0.05），pH在5.5～6.5范圍內乳酸量顯著降低（p≤0.05）。由于有機酸的積累，乳酸菌代謝多在低pH的酸性環境中進行，當環境pH降低到一定程度，乳酸菌將停止生長，影響了代謝產物的積累，所以出現了在pH=4、5條件下乳酸量降低的情況。在乳糖添加量相同時pH越大，發酵液顏色越深，作為豆腐凝固劑會影響到豆腐的外觀顏色，但又由于凝固劑應用在豆腐制作過程中要盡量避免酸澀感，所以，選擇pH=5.5左右進行正交實驗。

2.2.3乳酸菌接種量對菌株產酸量的影響不同接種量對產酸的影響結果如圖3所示。

圖3　不同接種量對乳酸菌產酸的影響Fig.3　Inoculum concentration effect on acid production

接種量影響乳酸的積累，隨著接種量的增加，培養環境中乳糖含量降低、pH降低，二者共同制約著乳酸菌的生長。分析圖3曲線可知，接種量在2%～6%時，乳酸量呈顯著增加趨勢（p≤0.05），6%～8%變化不顯著，8%～10%乳酸量顯著降低（p≤0.05），接種量在6%左右產酸量達到最大，因此選擇6%左右接種量進行正交實驗。

2.2.4培養溫度對菌株產酸量的影響在不同培養溫度下菌株產酸情況如圖4所示。

溫度是乳酸菌生長代謝的重要條件，溫度的不同既影響乳酸菌的生長又影響乳酸的積累。由圖4可知，培養溫度為37℃時，乳酸量為3.6g/L達到最大。在29～37℃范圍內，乳酸量變化呈顯著增加趨勢（p≤0.05），在37～45℃乳酸量變化顯著下降（p≤0.05）。因此，選擇37℃左右的培養溫度進行正交實驗。該結論與尚天翠和Betache［23-24］的乳酸菌是中溫微生物的結論是一致的。

圖4　培養溫度對乳酸菌產酸的影響Fig.4　Incubation temperature effect on acid production

2.2.5發酵時間對菌株產酸量的影響不同發酵時間對菌株產酸量的情況如圖5所示。

圖5　不同發酵時間對乳酸菌產酸的影響Fig.5　Fermentation time effect on acid production

隨著時間的延長，代謝產物逐步積累，隨著環境因子逐漸被消耗，乳酸量的積累在降低，圖5的這種趨勢符合這個解釋。發酵時間從48～60h乳酸量呈顯著增加趨勢（p≤0.05），從60～96h乳酸量增加緩慢，變化不顯著。在72h時產酸量為6.5g/L，84h時產酸量為6.6g/L，提高程度不高，浪費時間和資源。因此，選擇發酵時間72h左右進行正交實驗。

2.3正交實驗結果與分析

2.3.1正交實驗結果與方差分析根據以上單因素實驗結果，選擇乳糖添加量（A）、發酵初始pH（B）、接種量（C）、發酵時間（D）、培養溫度（E）5個因素進行正交實驗優化，確定各單因素對菌株產酸量的交互作用。正交實驗結果如表2所示，方差分析如表3所示。

根據正交實驗結果分析和方差分析可知，發酵時間具有顯著性，各因素對菌株產酸量的影響主次順序依次是：發酵時間、培養溫度、接種量、黃漿水初始pH、乳糖添加量。由正交結果與極差分析表中k值知，黃漿水初始pH的k3=k4，由于pH=6.5更接近于黃漿水pH，為節約操作時間，提高效率，故選擇pH=6.5（即B4）。綜上各因素對產酸量交互影響最佳方案為：A1B4C3D4E2，即發酵時間為84h，培養溫度為37℃，接種量為6%，黃漿水初始pH=6.5，乳糖添加量為1.5%。在該最佳培養條件下保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌共同發酵黃漿水產酸量可達5.1g/L。

表2　L16（45）正交實驗結果表與極差分析Table 2　Experimental results of L16（45）orthogonal array design and range analysis

表3　正交設計方差分析表Table 3　Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

2.4采用最優組合制作的豆腐理化指標測定

根據2.3所得最佳方案制備豆腐凝固劑并應用于豆腐制作過程中。對豆腐的出品率、黏聚性、硬度、蛋白質含量進行測定結果為：出品率為196.43%，黏聚性為261.42gs，硬度為419.15g，蛋白質含量9.62%。

2.5不同豆腐凝固劑制備方法比較

不同豆腐凝固劑制備方法比較結果見表4。

表4　不同凝固劑制備方法比較Table 4　Comparison of different preparation methods of coagulant

由表4可知，本方法制備的豆腐凝固劑具有一定的生理功能，并在應用中賦予豆腐特有的乳香味，且接種量小、節約資源，制備凝固劑過程較其他方法操作簡便。

3　結論

以豆腐黃漿水為原料，通過保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌共同發酵制備有機酸豆腐凝固劑。經單因素實驗確定各因素正交實驗的水平范圍，最終通過正交實驗確定最佳培養基及發酵條件。最優方案為：發酵時間為84h，培養溫度為37℃，接種量為6%，黃漿水初始pH=6.5，乳糖添加量為1.5%。在該最佳培養條件下保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌共同發酵黃漿水產酸量可達5.1g/L。通過驗證實驗驗證該培養基及發酵條件具有一定的可行性與可靠性。通過正交實驗驗證實驗驗證該最佳培養基及發酵條件具有一定的可行性與可靠性。在此工藝條件下豆腐出品率為196.43%，硬度為419.15g，黏聚性為261.42gs，蛋白質含量9.62%。

本方法與其他方法相比，具有凝固劑中乳酸含量高，改善豆腐凝固劑功能性，同時提高了豆腐中蛋白質含量的優點，但操作較費時。本實驗所得數據為研制新型豆腐凝固劑的研究提供基礎數據。

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Optimization of culture conditions for yellow serofluid fermented by double lactobacillus to prepare organic acid coagulant

LV Bo，LI Chen-chen，LIU Ning，LI Jian*
（Key Laboratory for Food Science and Engineering of Heilongjiang Province，College of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China）

Yellow serofluid of tofu was used as a raw material，organic acid coagulant was prepared by Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus fermentation.The influences of lactic acid content were investigated by initial pH，lactose content，fermentation time culture temperature and inoculate quantity. Orthogonal experiment was used to optimize carbon source and its fermentation condition.The optimize culture conditions of organic acid coagulant were showed as follows：lactose content 1.5%，initial pH=6.5，inoculate quantity 6%，culture temperature 37℃，fermentation time 84h.The lactic acid content under these conditions was 5.1g/L.Under the above process conditions，the rate of production，hardness，cohesiveness and protein content were 196.43%，419.15g，261.42gs and 9.62%respectively.Lactic acid content was increased and function of coagulant was improved by compare with other methods，protein content of tofu was also increased. Key words：yellow serofluid；Lactobacillus bulgaricus；Streptococcus thermophilus；organic acid coagulant；fermentation

TS201.3

A

1002-0306（2015）02-0212-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.037

2014－04－14

呂博（1990-），女，碩士研究生，研究方向：食品安全控制與分析檢測。

李?。?956-），男，本科，研究方向：農產品化學與綜合利用。

黑龍江省教育廳重點項目（12521z009）。