前列腺癌相關風險位點rs1800477在LNCaP細胞系功能研究

辛先祥 胡艷玲

【摘要】目的：驗證前期研究發現的前列腺癌相關風險位點rs1800477的功能。方法：選用前列腺癌LNCaP細胞系作為實驗細胞，針對位點rs1800477構建慢病毒載體，并轉染LNCap細胞，通過對LNCap進行劃痕實驗，比較各組的遷移率，實驗分為4組；空白對照組（CON）： 正常LNCap細胞未感染任何病毒的細胞組；陰性對照組（NC）：正常LNCap細胞加陰性對照病毒感染的細胞組；野生型組（OE-wt）：正常LNCap細胞加目的基因BCL2野生型病毒感染的細胞組；突變型組（OE-mu）：正常LNCap細胞加目的基因BEL2突變型病毒感染的細胞組。分別于6h和24h測量各組的細胞遷移距離并計算遷移率。結果：6h和24h時，野生型組和突變型組均出現差異，野生型組細胞遷移率分別為（0.24±0.02）%和（0.40±0.03）%，突變組細胞遷移率分別為（0.23±0.01）%和（0.41±0.03）%，與空白對照組比較差異均有統計學意義（p均<0.05），但野生型組與突變型組比較差異均無統計學意義（p=0.454、0.618）。結論：前期研究發現的風險位點rs1800477對前列腺癌細胞系LNCaP的遷移能力無顯著影響。

【關鍵詞】前列腺癌；LNCap；風險位點；功能研究

【中圖分類號】R737.25 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2015）03-0092-01

*基金項目：國家自然科學基金資助項目（No.81272853和No. 81060213）

廣西醫科大學研究生創新課題（No. YCSZ2014106）

前列腺癌在男性致死性疾病中排名第六，近20年前列腺癌全球內的發病率逐年增加[1]。2008年的一項對年齡小于75歲的男性前列腺癌調查研究報道顯示，有903500名男性被確診為前列腺癌，其中258400人因前列腺癌導致死亡。前列腺癌不僅能在因原位器官引起癥狀，轉移到其他器官引起的病癥能帶來更大的痛苦，這不僅增加了家庭的負擔還給全社會造成了很大影響。越來越多的科學家試圖從基因水平揭露前列腺癌的發病機制。遺傳多態性是最常見的遺傳變異，但遺傳因素導致的癌癥的確切機制還沒有研究清楚。單核苷酸多態性（SNPs）的研究表明位點突變通過與環境因素的相互作用引起相關癌癥的發生。位點的突變能夠引起相關氨基酸結構和功能的改變，從而導致癌癥的發生。在我們的前期研究[2]中發現位于BCL2基因的位點rs1800477通過關聯分析發現與前列腺癌存在相關，在本研究中用細胞劃痕實驗對上述結果進行驗證。

1材料與方法

1.1主要試劑與材料

LNCaP細胞系由天津南開大學贈送。Taq polymerase （SinoBio 批號E001-02B）， dNTP（Takara， 批號D4030A），胎牛血清（Gibco），REMI Medium 1640（Gibco），限制性內切酶（NEB），BamHI/Agel酶切（上海吉凱基因化學技術有限公司），GV166載體（上海吉凱基因化學技術有限公司），positive clone測序（美季生物技術，型號ABI3730），PCR儀（Applied Biosystems， 美國），細胞培養箱（上海一恒科學儀器有限公司），細菌搖床（華利達實驗設備公司，型號HI-92111K），37℃，Gilson移液器（吉爾森公司），5%CO2恒溫培養箱（CEDCO）。

1.2 過表達慢病毒載體的構建

1.2.1載體酶切： 基因信息：基因名稱為BCL2（NM-000633），物種為Human。載體信息：①載體名稱：GV166。②元件順序：Ubi-MCS-3FLAG-IRES-puro。③克隆位點：BamHI / AgeI。酶切反應體系：37℃，2h。試劑體積：ddH2O 42μL；10×buffer 5μL；純化的DNA質粒（1g/L） 2μL；Agel（5U/μL）。

1.2.2 目的基因片段的獲?。阂锝慌鋲A基、酶切位點，并含有目的基因5端部分序列用于PCR釣取目的基因，具體序列為：BCL2-F：aggtcgactctagaggatcccgccaccatggcgcacgggagaac；

BCL2-R：agtccatggtggcgaccggctgtggcccgataggcac。

PCR反應體系：ddH2O 12.4μL；5×Taq buffer 4μL；dNTPs（2.5mmol/L） 1.6μL；Primer（+）（10μmol/L） 0.4μL；Primer（-）（10μmol/L） 0.4μL；Template（10g/L） 1μL；Taq polymerase 0.2μL。PCR反應條件：94℃，5min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，2min；72℃，10min；4℃，∞ ；30cycle。

1.3 慢病毒的感染

⑴處于對數生長期的PC3細胞進行胰酶消化，制成細胞懸液。⑵將細胞懸液（細胞數約為5×104）接種于6孔板 中，37℃ 5%CO2 培養箱培養待細胞融合度達到約30%。⑶根據公式：MOI 值=病毒量×滴度/感染細胞數，各組MOI值均為20，可計算出各組需要加入的病毒量（NC組滴度為（2E+9）TU/mL，病毒加入量2μL；OE-mu組與OE-wt組滴度均為（2E+8）TU/mL，病毒加入量20μL）。感染條件為1640+10%FBS+5 g/L polybrene。⑷12h后觀察細胞狀態：如果有明顯的細胞毒性作用[5]，立即更換培養基；如果沒有明顯的細胞毒性作用，繼續培養24h后更換培養基。⑸感染3d后觀察慢病毒上報告基因GFP 的表達情況。⑹感染9d后進行細胞劃痕實驗，整個過程記錄細胞生長狀態變化。

1.4細胞培養和處理

用含有10%胎牛血清的培養液進行常規培養，放置于37℃，5%CO2 的恒溫培養箱。為保證細胞的正常生長，細胞液隔天進行更換。實驗分為4組，（1） 空白對照組（CON）： 正常LNCap細胞未感染任何病毒的細胞組； （2） 陰性對照組（NC）：正常LNCap細胞加陰性對照病毒感染的細胞組； （3） 野生型組（OE-wt）：正常LNCap細胞加目的基因BCL2野生型病毒感染的細胞組； （4） 突變型組（OE-mu）：正常LNCap細胞加目的基因BEL2突變型病毒感染的細胞組。

1.5劃痕實驗

按照實驗設計分為4組，往96孔板中加入約5X104個經慢病毒感染后的LNCap細胞。第2天上午換無血清培養基，使用劃痕儀對準96孔板的下端中央部位，向上輕推形成劃痕。使用無血清培養基輕輕漂洗2遍，加入無血清培養基，拍照0h。放入37℃5% CO2培養箱培養。培養8～24h后取出，熒光顯微鏡拍照（以96孔中心陰影區域為參照，劃痕在圖片的正中）。在0，6，24h進行圖像采集和細胞遷移距離的測量，將采集的圖像通過Image-Pro5.0軟件，計算各個時間點細胞未覆蓋的面積，并與0h時的無細胞區域面積比較以反映細胞的遷移率。每組實驗重復3次。

1.6數據分析

資料存放于Excel數據庫，每組均重復3次實驗因此用計算平均遷移率。LSD-T檢驗被用來比較兩組之間的差異。 若（P>0.05）認為具有統計學差異。 SPSS16.0被用來進行LSD-T檢驗和方差分析。遷移率計算公式：遷移率=（T0時面積-Tt時面積）/T0時面積×100%。

2 結果

2.1形態學觀察

LNCaP細胞轉染72小時后，在熒光顯微鏡（100×）下觀察和圖像采集，如圖1所示：可見CON組的細胞數明顯高于另外三組；NC組的細胞數略高于OE-wt和OE-mu組；OE-wt和OE-mu細胞數差別不大；四個組的細胞形態沒有區別，均生長良好。以上結果可以表明rs1800477的突變對前列腺癌LNCaP細胞的遷移無明顯作用。

2.2劃痕實驗

在0小時，6小時和24小時分別測量并記錄了四組細胞均出現遷移變化（表1），并計算平均遷移率。遷移率比較（表2，3）顯示，在6小時突變型和野生型遷移率變化均出現差異，P值分別為0.009，0.036；24小時仍有顯著差異，P值分別為0.012，0.007。但野生型與突變型相比無顯著差異，6小時和24小時的P值分別為0.453，0.617，表明位點rs1800477對前列腺癌LNCaP細胞系的轉移并無顯著影響。

表1. 四組細胞遷移距離信息表

時間 CON NC OE-WT OE-MU0 h 30.8 26.78 28.4 30.97 26.95 30.55 28.86 24.73 30.66 28.96 28.54 30.976 h 21.63 18.91 20.71

3 討論

前列腺癌發病率的逐年增高和轉移性已經引起全球的廣泛關注。飲食習慣、種族、性行為方式、病毒感染等因素均能對前列腺癌的發病造成影響[3]。對前列腺癌的研究已經不再局限于宏觀改善癥狀，現在的研究主要集中于從分子層面探索前列腺癌發病機制，進一步找到預防和治療方法。LNCaP細胞系是從人類前列腺癌淋巴轉移細胞中分離出來，保留了前列腺癌細胞的分化和增值特性[4]。

隨著測序技術的發展，越來越多的前列腺癌相關的風險位點被發現，為我們的后續研究提供了豐富的資源，許多研究生人員進行了單核苷酸多態性與前列腺癌關系的研究，并驗證了相關位點與前列腺癌的相關性。一項研究發現位于NKX3.1上位點rs2228013的突變能夠增加前列腺癌的轉移[5]。另一項病例對照研究發現了位于CYP19A1的風險位點rs4775936，前列腺癌患者中突變型的生存時間比野生型的明顯縮短，這項發現已經在DU145和PC3細胞系中驗證。作為BCL2基因家族的一員，BCL2基因能夠通過誘導相關基因的表達來調控細胞的程序性凋亡。RTK/ERK信號通路已經被廣泛的證明與前列腺癌相關的重要通路，作為信號通路中的關鍵基因BCL2能夠通過調控通路中相關基因的泛素化和磷酸化而影響基因的表達，進一步導致前列腺癌的發生和轉移。研究人員在DU145細胞系中發現BCL2表達程度的降低能夠選擇性降低ERK1/2，AKT信號通路的活性，并顯著降低腫瘤的發生率。

我們的研究位點rs1800477位于18號染色體，該位點尚未報道與癌癥相關。在一項對漢族人群的研究中發現rs1800477的突變能將原來編碼的丙氨酸變為蘇氨酸能導致男性少精。我們前期通過在中國前列腺癌協作組完成的全基因組掃描數據中進行rs1800477進行大樣本的關聯分析發下，該位點顯著與前列腺癌的發生存在相關性。但本研究在LNCaP細胞系的功能驗證說明rs1800477與前列腺癌無明顯相關性。本實驗只在LNCaP一種細胞系中進行驗證，有一定的局限性，臨床原始樣本基因組掃描發現的風險位點，用于單一細胞系中驗證，不能全面驗證位點rs1800477與前列腺癌的關聯性。后續實驗欲在其他細胞系中進行功能驗證。

參考文獻

[1]Plata BA， Concepcion MT. Prostate cancer epidemiology[J]. Arch Esp Urol， 2014，67（5）： 373-82.

[2] Chen Y， Xin X， Li J， et al. RTK/ERK pathway under natural selection associated with prostate cancer. PLoS One[J]. 2013， 8（11）： e78254.

[3] Nelson WG， De Marzo AM， Isaacs WB. Prostate cancer. N Engl J Med[J]. 2003，349（4）： 366-81.

[4] 林艷端，申鍔，胡兵. 三種常見的前列腺癌細胞系LNCaP、PC3、DU145的生物學特性[J]. 中華臨床醫師雜志， 2013，7（11）：4980-4982.

[5] Muhlbradt E， Ma J， Severi G， et al. Variant NKX3.1 and Serum IGF-1： Investigation of Interaction in Prostate Cancer[J]. Genes Cancer， 2013， 4（11-12）： 535-45.