維生素D對牛卵巢卵泡顆粒細胞的影響

靳 光，張元慶，張喜忠，王 曦，王棟材，李 博，薛艷蓉

（山西省農科院畜牧獸醫研究所，太原 030000）

繁殖與生理

維生素D對牛卵巢卵泡顆粒細胞的影響

靳 光，張元慶，張喜忠，王 曦，王棟材，李 博，薛艷蓉

（山西省農科院畜牧獸醫研究所，太原 030000）

試驗旨在探尋具有生物活性的維生素D（1α，25-（OH）2D3）對體外培養的牛卵巢卵泡顆粒細胞的活力、增殖及雌激素分泌的影響。在體外培養的牛卵巢卵泡顆粒細胞中加入不同梯度的1α，25-（OH）2D3（0，1，10，100 nM），用CCK-8檢測細胞活力，細胞計數檢測增殖，ELISA法檢測雌二醇濃度。結果表明：1、10、100 nM的1α，25-（OH）2D3均能提高卵泡顆粒細胞的活性，1α，25-（OH）2D3為100 nM時其刺激作用最強；10、100 nM的1α，25-（OH）2D3能刺激卵泡顆粒細胞增殖與雌二醇分泌，100 nM的1α，25-（OH）2D3刺激增殖作用最強，10 nM的1α，25-（OH）2D3刺激雌二醇分泌的能力最強。

維生素D；牛；卵泡顆粒細胞；細胞活力；增殖；雌二醇

維生素D是一種脂溶性維生素，其主要作用是升高血漿中鈣、磷的水平，以促進骨的鈣化。維生素D可以通過食物攝取也可以在體內合成。維生素D在體內代謝產物有數十種，但在體內最終的活性形式只有一種，那就是1α，25-二羥維生素D3（1α，25-（OH）2D3）［1-2］。

1α，25-（OH）2D3發揮其生物學作用需要靶細胞上維生素D受體（VDR）的介導。VDR是核受體家族成員之一，調控了人及小鼠約3%的基因表達［1，3］。隨著研究的深入，人們發現VDR存在于雄性動物的睪丸、附睪、前列腺、精囊腺等重要器官［4-5］。另外，在人精子內VDR存在于精子細胞核內［6］。VDR在雄性動物生殖系統內的表達，說明1α，25-（OH）2D3能夠在其中發揮調節作用。

維生素D對生殖的影響已有諸多研究。對于VDR基因敲除的小鼠其精液品質下降，表現為精子數目與精子活率降低，精子形態異常［7］。對于未成熟大鼠的睪丸支持細胞，1α，25-（OH）2D3能夠提高芳香化酶（控制雌激素生成的關鍵酶）mRNA的表達量［8］。對于精子，1α，25-（OH）2D3能夠增加精子細胞內鈣離子濃度，提高精子運動能力和頂體酶活性，有利于精子獲能并延長精子體外生存時間［9-10］。

雖然維生素D對于雄性動物生殖的影響已有大量研究，但是對于雌性動物的研究較少，并且維生素D對母牛生殖方面的研究還未見報道。因此，本試驗以母牛為研究對象，探究維生素D對母牛卵巢卵泡顆粒細胞的細胞活力、增殖以及雌激素分泌水平的影響。

1　材料與方法

1.1樣品采集

選取健康的成年山西省晉南牛作為研究對象，在當地屠宰場將動物宰殺后采集卵巢。迅速用生理鹽水沖洗卵巢并放入4℃無菌PBS緩沖液內，2 h內帶回實驗室。

1.2主要試劑

DMEM/F12基礎培養基、青鏈霉素混合液、Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒購于武漢博士德生物公司；胎牛血清（FBS）購于杭州四季青公司；牛雌二醇ELISA試劑盒購于上海藍基生物公司；1α，25-（OH）2D3購于Selleck公司。

1.3牛卵巢卵泡顆粒細胞的收集

無菌條件下將卵泡從卵巢上剪下，然后剪開卵泡，用刮刀刮取卵泡壁內層的卵泡顆粒細胞。用PBS將收集的卵泡顆粒細胞清洗3次，然后用臺盼藍鑒定活細胞。

1.4CCK-8測定細胞活性

將收集的卵泡顆粒細胞以每孔1×104個活細胞接種于96孔培養板內。培養液為DMEM/F12，其中含有10%FBS、100 IU/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素以及不同濃度梯度的1α，25-（OH）2D3（0、1、10、100 nM），每孔內含培養液100 μL。每個1α，25-（OH）2D3濃度梯度設定5個復孔，試驗重復6次。卵泡顆粒細胞在37℃，5%CO2濃度條件下培養24 h。24 h以后每孔加入10 μLCCK-8溶液，繼續培養3 h。3 h后使用酶標儀測定培養板內各孔在450 nm下的吸光度值。

1.5雌二醇測定及細胞計數

將收集的卵巢卵泡顆粒細胞以每孔5×104個活細胞接種于96孔培養板內。培養液組成及1α，25-（OH）2D3濃度梯度同上，每孔內含培養液200 μL。每個1α，25-（OH）2D3濃度梯度設定3個復孔，試驗重復6次。卵巢顆粒細胞在37℃、5%CO2濃度條件下培養6 d，期間每48 h換液一次。6 d以后抽取細胞上清液，用牛雌二醇ELISA試劑盒，按其說明書步驟對各樣品雌二醇濃度進行測定。吸取上清后，用胰酶消化剩余細胞，將細胞吹散后終止消化，然后用血細胞計數板對各個孔細胞進行計數。

1.6統計分析

所有數據應用SPSS軟件進行分析，數據以平均數±標準誤表示。方差分析使用單因素方差分析，多重比較采用Duncan法。

2　結果

2.11α，25-（OH）2D3對牛卵泡顆粒細胞活力的影響

牛卵泡顆粒細胞經體外培養24 h后，不同濃度1α，25-（OH）2D3對牛卵泡顆粒細胞活力的影響如圖1所示。與不添加1α，25-（OH）2D3的對照組相比，當1α，25-（OH）2D3添加量為1、10、100 nM時，顆粒細胞的活力都有顯著提高（P<0.01）。當添加濃度為100 nM時，顆粒細胞的活力最高。

圖1　1α，25-（OH）2D3對牛卵巢卵泡顆粒細胞活力的影響

2.21α，25-（OH）2D3對牛卵泡顆粒細胞增殖的影響

牛卵泡顆粒細胞經體外培養6 d后，不同濃度1α，25-（OH）2D3對牛卵泡顆粒細胞增殖的影響如圖2所示。與不添加1α，25-（OH）2D3的對照組相比，當1α，25-（OH）2D3添加量為10、100 nM時，顆粒細胞的數目都顯著提高（P<0.01），當添加濃度為100 nM時，顆粒細胞的數目最多。

圖2　1α，25-（OH）2D3對牛卵巢卵泡顆粒細胞增殖的影響

2.31α，25-（OH）2D3對牛卵泡顆粒細胞雌二醇分泌的影響

牛卵泡顆粒細胞經體外培養6 d后，不同濃度1α，25-（OH）2D3對牛卵泡顆粒細胞雌二醇分泌的影響如圖3所示。與不添加1α，25-（OH）2D3的對照組相比，當1α，25-（OH）2D3添加量為10、100 nM時，卵泡顆粒細胞雌二醇分泌顯著提高（P<0.01），當添加濃度為10 nM時，顆粒細胞雌二醇分泌量最大。

圖3　1α，25-（OH）2D3對牛卵巢卵泡顆粒細胞雌二醇分泌的影響

3　討論

維生素D是一種脂溶性維生素，屬于類固醇激素家族的一員。近年來，維生素D對動物生殖的影響多有報道，但是對母牛生殖的影響未見報道。本研究首次以母牛為研究對象，探尋了維生素D對母牛卵巢卵泡顆粒細胞的影響。卵巢卵泡顆粒細胞是雌性動物至關重要的細胞，因為它是雌激素的主要來源，而雌激素決定了雌性動物的性成熟與生殖。

CCK-8近來廣泛用于細胞活力檢測［11］，其能與細胞線粒體內脫氫酶進行反應，生成黃色的甲瓚化合物，顏色越深則說明細胞活力越強。本研究用CCK-8證明1α，25-（OH）2D3對卵泡顆粒細胞活力有促進作用。顆粒細胞的活力越強則其增殖與分泌功能也應越強，隨后對于顆粒細胞增殖的試驗與雌二醇分泌的試驗也證實了這一點。不過對于雌二醇而言，1α，25-（OH）2D3對其的最佳刺激濃度并不是100 nM，而是10 nM。這一點不同于細胞活力試驗與細胞增殖試驗的結果?？赡苁?α，25-（OH）2D3對雌二醇分泌的調節機制不同于另外兩者，因此造成了這樣的差異。

1α，25-（OH）2D3對細胞增殖的影響在非生殖細胞內早有研究［12］，本研究也證明了1α，25-（OH）2D3對卵泡顆粒細胞的增殖有促進作用，并且對雌二醇的分泌也有促進作用。牛卵泡發育呈現卵泡波的形式，顆粒細胞增殖與其分泌的雌二醇在卵泡發育中起到至關重要的作用。在同一波的卵泡中，只有優勢卵泡才能一直發育并最終排卵，而其它卵泡都不得不閉鎖退化掉。而優勢卵泡的特點就是顆粒細胞增殖迅速，雌二醇分泌旺盛［13-14］。母牛自出生之日起，其卵巢內卵子數目便不會再增加。但是母牛的卵泡會不停地閉鎖退化，導致母牛終生可用的卵子數目不足1%。1α，25-（OH）2D3對母牛卵泡顆粒細胞的增殖及雌二醇的分泌都有促進作用，或許會因此改善母牛的生殖能力，對于這一點還需要繼續深入研究。

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Effects of Vitamin D on Follicular Granulose Cells of Cattle Ovarian

Jin Guang，ZhangYuanqing，Xue Yanrong，et al
（Animal Husbandryand VeterinaryInstitute，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan,030000，China）

The objectives of present study were to investigate the effects of bioactive vitamin D（1α，25-（OH）2D3）on cell viability，proliferation and estradiol production of follicular granulose cells of cattle ovarian in vitro.The granulose cells were cultured with different concentrations of1α，25-（OH）2D3，then the cell viabilitywas measured byCCK-8，the cell proliferation was measuredby cell counting and the concentrations of estradiol were measured by ELISA.The results showed that 1α，25-（OH）2D3（1，10，100 nM）enhanced cell viability，100 nM1α，25-（OH）2D3worked best.The results also showed that 1α，25-（OH）2D3（10，100 nM）enhanced cell proliferation and estradiol production.When the concentration of1α，25-（OH）2D3was 100 nM，the stimulation on cell proliferation was the strongest.While the concentration of 1α，25-（OH）2D3was 10 nM，the stimulation on estradiol production was the strongest.

vitamin D；cattle；follicular granulose cell；cell viability；proliferation；estradiol

S823.3

A

2095-3887（2015）03-0019-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.03.006

2015-02-16

山西省研究生創新項目（20133056）

靳光（1981-），男，助理研究員，碩士。

薛艷蓉（1982-），女，助理研究員，碩士。