基于線粒體DNA D-loop區部分序列分析舟山海域帶魚種群遺傳結構

鄭文娟 杜一超 林 潔 蔣晨華 丁沃娜 朱世華

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基于線粒體DNA D-loop區部分序列分析舟山海域帶魚種群遺傳結構

鄭文娟 杜一超 林 潔 蔣晨華 丁沃娜 朱世華

(寧波大學科學技術學院, 寧波 315212)

帶魚; 線粒體DNA; D-loop區; 遺傳多樣性; 舟山

帶魚(Linnaeus), 俗稱刀魚、白帶魚, 隸屬鱸形目(Perciformes), 帶魚科(Trichiuridae), 帶魚屬(), 廣泛分布于世界各溫熱帶海域, 在我國主要分布在東海、南海、黃海和渤海[1]。帶魚為我國最重要的捕撈對象, 其產量多年來一直位居我國海洋捕撈魚類產量的首位, 占有十分重要的漁業經濟地位。舟山帶魚是全國首批海鮮類地理標志證明商標海鮮, 曾與大黃魚、小黃魚、墨魚并稱為我國“四大漁業”。自20世紀70年代后, 由于受過度捕撈和環境變化等影響, 舟山海域的帶魚資源出現了嚴重衰退; 1989年起我國在東海區實施了帶魚主要產卵場5—6月禁捕制度和1995年起實施伏季休漁漁業管理, 經過10多年較為有效地實施, 帶魚的年平均資源量有較大的增長, 漁獲質量也有很大的改善。但在當今巨大的捕撈壓力下, 帶魚種群組成小型化、性成熟提早、單位漁獲量下降等生長型過度捕撈現象還比較明顯, 帶魚資源仍處于緩慢衰退之中[2]。

目前, 國內對帶魚的研究主要集中于其生物學特征、年齡與生長、攝食習性、漁業資源等幾個方面[3—6], 對帶魚的遺傳多樣性研究較少, 國內一些學者已應用RAPD、16S rRNA[7]、同工酶[8]、D-loop區[9]和COI[10]等技術對不同海域的帶魚種群進行分析, 而對舟山海域帶魚種群遺傳多樣性的系統研究未見報道。線粒體DNA D-loop區序列由于不編碼蛋白質而不受自然選擇的影響, 因而進化速率最快, 積累了較多的突變, 如堿基替換、插入、缺失, 以及眾多的串聯重復序列等, 所以在種群遺傳學分析中得到普遍應用[11, 12]。本研究擬通過對舟山海域帶魚的線粒體DNA D-loop區部分序列的測定, 來探討其種群遺傳結構, 為今后長期可持續利用和保護帶魚資源奠定良好的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

帶魚樣本于2013年的4月、5月、7月隨機采集于舟山金塘、沈家門、定海的3條漁船, 試驗魚取其肌肉組織, 用95%酒精固定, 運回實驗室保存于–20℃。

1.2 方法

基因組DNA提取從保存的樣本中隨機抽取54個樣本, 3批樣本標號為: D1-01至D1-18(種群1, 4月采自金塘), D2-01至D2-19(種群2, 5月采自沈家門), D3-01至D3-17(種群3, 7月采自定海)?；蚪MDNA從保存于95%酒精的肌肉樣品中提取, 參考《分子克隆實驗指南》的酚/ 氯仿抽提法[13], 提取并純化帶魚基因組DNA, 經1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證提取的基因組DNA是否斷裂和降解, 用Nanodrop 2000測DNA的濃度和質量, 保存于–20℃備用。

PCR擴增從GenBank下載帶魚線粒體DNA 全長(Genbank No: NC_011719)序列, 用Oligo軟件設計擴增帶魚線粒體DNA控制區部分序列的引物如下: DLF490: 5￠-ATACCAGGACTCAACATCTCT-3￠; DLR996: 5￠-TTTG CAGGACCATAAGTAAC-3￠。PCR反應體系為25 μL: Buffer緩沖液(含Mg2+)2.5 μL, dNTPs (10 mol/L) 0.5 μL,酶0.5 μL, 上、下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL, 模板DNA (約為100 ng) 1 μL, 滅菌蒸餾水19.5 μL。PCR反應條件為: 94℃預變性4min; 94℃變性30s, 52℃退火30s, 72 ℃延伸45s, 34個循環; 72℃延伸15min; 反應設立不含DNA模板的空白對照, 擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證。

PCR產物電泳割膠回收, 用凝膠純化試劑盒(上海生工)純化, 與pUCm-T載體(上海生工)連接, 轉化感受態細胞DH5α, 篩選陽性克隆子, 擴大培養后用質粒抽提試劑盒(上海生工)提取質粒, 用M13引物在自動測序儀(Applied Biosystems 3730, 上海英俊)正反雙向測序, 以保證所測序列的準確性。

數據處理經NCBI網站blast驗證所得的帶魚線粒體DNA控制區部分序列, 應用Clustal X1.8軟件進行多重序列的比對, 并輔以人工校正; 用MEGA5.0軟件統計堿基組成, 轉換顛換比(Ts/Tv)及應用Kimura雙參數法計算遺傳距離[14], 并用該軟件的鄰接法(Neighbor-joining, NJ)構建帶魚單倍型系統發育關系樹, 以南海帶魚()(Genbank No: NC_018791)為外類群, 以Kimura雙參數法為替代模型, 系統樹分支的置信度采用自展法(Bootstrap analysis, BP)重復檢測1 000次。利用DnaSP4.0軟件統計單倍型及多態位點()、計算單倍型多樣性(d), 平均核苷酸差異數()及核苷酸多樣性()。用Arlequin 3.11軟件[15]計算Tajima’s和Fu’ss值(1000次重復隨機抽樣重排后進行顯著性檢驗), 并進行核苷酸不配對分布(Mismatch distribution), 并獲得值, 來檢測舟山帶魚種群的歷史動態。群體歷史擴張時間用參數=2進行估算[16], 其中是擴張時間參數;=2,為變異速率,表示序列長度;表示自擴張以來所經歷的代數; 擴張時間=×代時, 代時由研究對象的性成熟年齡決定。在本研究中, 世代時間設置為1年[3], 控制區分化速率分別采用3%—10%/MY (Million year)[17]。

2 結果

2.1 舟山帶魚種群的mtDNA控制區堿基組成

本實驗帶魚種群mtDNA D-loop區域部分序列上傳至GenBank, 序列號為KP689433-kp689486。54個帶魚個體的mtDNA 控制區部分序列長度介于525—527 bp, 堿基長度基本保持一致。T、C、A、G這4種堿基的平均含量分別為31.7%、22.0%、26.8%和19.5%, 其中A+T (58.5%)的含量高于G+C (41.5%)的含量, 這個現象與其他魚類的控制區的堿基含量相似。

2.2 舟山帶魚種群的mtDNA控制區序列多態性

在54個舟山帶魚的mtDNA 控制區部分序列中, 共發現58個變異位點, 占分析位點總數的11.0%, 2個插入或缺失位點, 其中單一突變位點有26處, 兩核苷酸間變異的突變位點有25處, 三核苷酸間的變異有1處; 其他32處均為簡約信息位點, 其突變位點為兩核苷酸間的變異有27處, 三核苷酸間的變異有5處, 所有的突變位點均為兩核苷酸或三核苷酸間的變異, 并未發現四核苷酸間的變異; 轉換/顛換平均值為3.935。帶魚個體間遺傳距離為0.000—0.038, 平均遺傳距離()為0.012。3個地理種群內的平均遺傳距離: 種群1為0.013, 種群2為0.014, 種群3為0.010; 種群間的平均遺傳距離: 種群1與種群2為0.014, 種群1與種群3為0.012, 種群2與種群3為0.012, 種群內與種群間的遺傳距離相差很小。同時3個種群間的ST值都很小, 且種群1和種群2間的ST值為–0.009, 種群1和種群3間為–0.002, 都是負數, 種群2和種群3間的ST值為0.009, 說明種群間存在較大的基因流, 遺傳分化不明顯。54個帶魚個體中共檢測出45個單倍型, 其中D1-02和D3-17, D2-19、D3-11和D3-13, D2-04、D2-15和D2-18, D1-15和D2-05, D2-08和D3-15, D1-11、D3-02和D3-06之間共享單倍型, 單倍型多樣性(d)為0.991, 核苷酸多樣性()為0.012, 平均核苷酸差異數()為6.441。

2.3 舟山帶魚種群遺傳結構

根據mtDNA D-loop區部分序列, 以南海帶魚為外群, 用MEGA 5.0構建了54個帶魚個體的NJ樹見圖1。枝上的數值是1000次重復抽樣檢驗的置信度值(僅顯示支持率大于50%的數據)。根據圖1所示, 共享單倍型的個體間都聚成一支, 3個種群內的個體間并沒有明顯的聚簇現象出現, 種群間互相散布交叉現象比較普遍, 這個結果與種群內與種群間的遺傳距離相差微小和種群間的分化指數ST低相符。

2.4 舟山帶魚種群歷史動態

根據Tajima’s和Fu’ss值中性檢驗以及舟山帶魚群體堿基錯配分布曲線是否呈現多峰或單峰型來判定舟山帶魚種群在過去是否發生了群體擴張。結果顯示, Tajima’s值為-1.701 (=0.012<0.05), Fu’ss=-25.109 (=0.000<0.05), 同時根據線粒體DNA D-loop區部分序列多態性, 舟山帶魚種群的單倍型核苷酸不配對分布曲線為明顯的單峰泊松分布, 并且與群體擴張模型下的預期分布相吻合(圖2), 結合三者說明舟山帶魚種群可能經過群體擴張。在本研究中,=5.197,=527, 代時取1, 計算得到值為0.082—0.025 MY, 說明帶魚種群擴張時間約為更新世晚期(冰河期)。

3 討論

近年來, 由于過度捕撈和沿海水體遭受污染等因素, 我國許多海洋經濟魚類資源面臨著衰退, 除直觀看得到的單位漁獲量下降、低齡化、小型化、性成熟提早等現象, 物種的遺傳多樣性也都在逐漸降低[18—20]。從遺傳學和進化角度看, 物種的遺傳多樣性降低可能導致物種對環境的適應能力和生存能力降低, 物種退化, 極端情況下甚至威脅物種生存。

3.1 舟山帶魚種群遺傳多樣性

本研究采用的是帶魚mtDNA D-loop區的部分序列, 去除了終止序列區(Termination associated sequence)和保守序列區(Conserved sequence blocks)的后續序列, 這是因為根據報道發現在帶魚的終止序列區(TAS)有6—7個57 bp的重復序列, 以及保守序列區(CSB)的后續序列中有2—3個12 bp的重復序列[21], 因此如果擴增mtDNA D-loop區全序列, 會因為重復序列的個數差異導致整個群體遺傳多樣性的結果會偏高。

本研究通過對舟山海域帶魚線粒體DNA D-loop區部分序列的測定, 發現54個個體中共檢測到58個多態位點, 44個單倍型, 單倍型多樣性(d)為0.991, 核苷酸多樣性()為0.012, 平均遺傳距離()為0.012, 平均核苷酸差異數()為6.441。相比2003年, 蒙子寧等采用mtDNA 16S rRNA分子標記對黃海帶魚(=12)進行DNA多態性分析, 結果表明, 12個個體只有3個單倍型, 單倍型多樣性(d為0.25, 平均遺傳距離()為0.001[7]; 2013年李鵬飛等[10]利用mtDNAⅠ序列對浙江近海水域帶魚群體(=15)進行分析得出: 15個序列檢測到10個單倍型, 核苷酸多樣性為0.00513, 平均核苷酸差異數為3.124; 以上兩研究相比本實驗單倍型多樣性、平均遺傳距離和核苷酸多樣性指數均要低, 這是因為mtDNA 16S rRNA和Ⅰ相對D-loop區較保守, 其次是兩研究的實驗樣本數不多。2011年, 肖永雙采用D-loop區部分序列(556 bp)對3個地理群體[北海(=14)、溫州(=20)、南海(=20)]的帶魚進行遺傳多樣性研究, 結果顯示, 54個個體共檢測到40種單倍型, 3個地理群體單倍型多樣性(d)指數也都較高, 依次為從0.97± 0.04、0.99±0.02、0.98±0.02, 平均核苷酸差異數() 依次為4.66±2.43、4.87±2.48、4.65±2.38[9], 以上分析數據和本實驗相差無幾, 這也綜合體現了國內各個海域的帶魚的遺傳變異基本處于同一水平。

目前已運用線粒體DNA D-loop區對舟山海域的刀鱭()[22]、鰳魚()[23]、褐牙鲆()[24]、灰鯧()[25]、大黃魚()[19]、小黃魚()[20]等6種魚類的種群遺傳結構進行研究分析, 其中單倍型間的核苷酸多樣性()、平均遺傳距離()、單倍型多樣性(d)是衡量一個種群mtDNA遺傳變異的重要指標[26]。2008年, 楊金權等[22]研究發現舟山海域的7個刀鱭樣本的平均單倍型多樣性(d)為1.0000, 平均核苷酸多樣性()為0.0089; 2010年, 毛勇等[19]對舟山岱衢族大黃魚群體23個個體進行分析, 結果表明, 平均單倍型多樣性(d)只有0.087, 核苷酸多樣性()為0.00056, 遺傳距離值為0.00058; 2012年鄭文娟等對舟山小黃魚群體53個個體遺傳多樣性分析所得: 單倍型多樣性(d)為0.9993, 單倍型間的平均遺傳距離為0.012, 核苷酸多樣性()為0.01233[20]; 以上研究結果再加Grant & Bowen綜述各種海洋魚類的線粒體DNA單倍型多樣性(d)為0.11—1.00, 核苷酸多樣性()為0.0008—0.0320[27], 就單倍型多樣性(d)而言, 舟山帶魚處于較高水平; 但結合帶魚種群的平均遺傳距離()以及核苷酸多樣性()就會發現, 舟山帶魚的遺傳多樣性還只處于中等水平。

3.2 舟山帶魚種群遺傳結構

本實驗采自舟山金塘、沈家門、定海的3個種群內平均遺傳距離分別為: 0.013、0.014、0.010, 同時3個種群間的平均遺傳距離在0.012—0.014, 種群內與種群間的遺傳距離相差很小, 這也在一定層面上表明目前舟山海域帶魚種群的遺傳多樣性水平。Shaklee等[28]提出魚類在屬、種和種群三級水平上的遺傳距離值分別為0.90、0.30及0.05, 本研究明顯比Shaklee等提出的數據低, 3個舟山地理種群間遠未達到種群分化標準。根據MEGA 5.0構建了54個帶魚個體的NJ樹也發現, 3個種群間的個體互相穿插, 并未形成各自種群內特定一支。同時st結果也顯示3個帶魚種群間存在負值現象, 表明種群內個體間的差異大于種群間的差異水平, 表明舟山海域各區域間不存在顯著的遺傳分化, 區域間是隨機交配的。這是因為東海帶魚在越冬、生殖、索餌等階段進行洄游, 主要屬南北往返性質, 也有東南-西北向洄游規律。主要越冬場在浙江東南部外海、福建近外海和臺灣海峽沿岸一帶, 春季進行生殖和索餌洄游, 魚群向北移動, 北界可達東海北部海域, 秋末開始進行越冬往南洄游。東海帶魚在洄游過程中, 相互交匯在一起, 具有較強的擴散潛力, 所以群體間不會出現顯著的遺傳分化, 這和劉子藩等的結論(東海帶魚, 不論近?；蛲夂５娜后w系同一個種群)相一致[29]。同樣肖永雙對北海、溫州和南海的進行遺傳分化發現這3個種群各自所屬的單倍體也相互交叉, 未與采樣地點相對應的同一分支[9]。

若Tajima’s值顯著偏離中性檢驗, 而且核苷酸錯配曲線呈現單峰分布, 則表明群體在過去經受了擴張, 反之, 群體保持穩定[30]。本研究結果顯示Tajima’s值為–1.701 (=0.012<0.05), 帶魚線粒體DNA D-loop區的單倍型核苷酸不配對分布基本表現出明顯的單峰泊松分布, 同時群體擴張通常產生絕對值較大的負的s值[31], 帶魚種群的Fu’ss=-25.109 (=0.000<0.05), 這說明舟山帶魚群體確實經歷了群體擴張。通過計算值我們估計帶魚種群擴張時期約在8.2萬至2.5萬年前, 處于冰河期。因為第四紀末期的更新世晚期有幾次冰期與間冰期旋回, 曾引起海平面的升降, 現生海洋物種的分布及種群遺傳結構大多受到這種冰期旋回的影響。牛素芳等研究認為, 更新世后的海平面上升事件對東海魚類的mtDNA遺傳結構具有重要影響[32], 如高眼鰈()、斯氏美首鰈()、長鰈()[9]、小黃魚[20]、竹莢魚()[32]等都在更新世冰期進行了群體擴張, 這也使得我國近海這些魚類群體間遺傳差異不顯著。

3.3 展望

東海區海域是帶魚良好的產卵場與索餌場, 以舟山和嵊泗漁場最為著名, 而且舟山帶魚是全國首批海鮮類地理標志證明商標海鮮, 具有較高的海洋漁業經濟價值。從1995年實施伏季休漁漁業管理, 經過10多年較為有效地實施, 東海區帶魚的年漁獲量開始出現了持續增加之勢, 但每年伏季休漁結束開捕后, 在強大的捕撈壓力下, 難于釋放幼魚群體, 到冬季時, 親體的殘存數量大幅減少, 以致其群體結構仍處于小型化、低齡化, 漁獲質量未能得到根本地改善。結合本研究中舟山帶魚種群的遺傳多樣性只處于中低水平來看, 必須采取更科學、更嚴格的管理措施。農業部于2008年12月公布了東海帶魚國家級水產種質資源保護區, 2010年正式啟動, 2013年浙江省海洋與漁業局發布《浙江省2013年海洋禁漁通告》, 首次規定東海帶魚保護區核心區將實行禁漁。該保護區位于浙江沿岸中北部海域, 跨舟山漁場和魚山漁場, 總面積約2.2′104km2, 不僅是我國沿海最大的水產種質資源保護區之一, 也是東海帶魚最重要的產卵場、索餌場和洄游通道等主要的生長繁育區域, 這將為帶魚資源的利用和保護提供有利的平臺, 如此期望帶魚資源走向可持續發展的道路。

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GENETIC DIVERSITY ANALYSIS OFIN ZHOUSHANBASED ON MITOCHONDRIAL DNA D-LOOP REGION PARTIAL SEQUENCES

ZHENG Wen-Juan, DU Yi-Chao, LIN Jie, JIANG Chen-Hua, DING Wo-Na and ZHU Shi-Hua

(College of Science & Technology, Ningbo University, Ningbo 315212, China)

; Mitochondrial DNA; D-loop region; Genetic diversity; Zhoushan

10.7541/2015.53

Q349+.1

A

1000-3207(2015)02-0408-06

2014-05-15;

2014-11-18

浙江省教育廳一般科研項目(Y201430356); 寧波大學校級科研項目(XYL14030)資助

鄭文娟(1982—), 女, 浙江湖州人; 研究生, 助理研究員; 主要從事水產資源研究。E-mail: zhengwenjuan@nbu.edu.cn

朱世華(1963—), E-mail: zhushihua@nbu.edu.cn