不同氮源及CO2濃度下湖泊微擬球藻的生長及產油特性分析

李鳳娟 萬 秀 方仙桃 胡 銳 高大文 胡晗華

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不同氮源及CO2濃度下湖泊微擬球藻的生長及產油特性分析

李鳳娟1萬 秀2方仙桃2胡 銳2高大文1胡晗華2

(1. 哈爾濱工業大學城市水資源與水環境國家重點實驗室, 哈爾濱 150090; 2. 中國科學院水生生物研究所, 武漢 430072)

湖泊微擬球藻; 三?；视? 生物柴油; 氮利用

工業生產排放的各種廢氣與污水污染人類賴以生存的環境?；剂先紵欧懦龃罅緾O2外, 還釋放出含有粉塵、SOx和NOx等直接危害人類健康的有毒成分[1]。其中NOx與水結合后最終會轉化成硝酸鹽或亞硝酸鹽等[2], 導致污水中的含氮化合物氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮和有機氮的含量通常偏高。如何有效去除污水中的氮是防治水體污染最關鍵的步驟之一, 而利用微藻培養去除水體中的氮源是目前研究的熱點。盡管生物燃料生產的成本遠高于化石燃料, 且微藻培養過程中消耗僅與產出的能量相當, 但生物燃料包括微藻生物質在替代減排上的潛力巨大, 使得微藻生物質仍被認為是最有前途的生物燃料之一[3]。將微藻生物質生產與污水處理和廢氣利用相結合, 可在減少碳排放的同時增加經濟效益, 由此使得利用微藻作為生產生物質的原料變得經濟可行。

微擬球藻()是一類屬于真眼點藻綱(Eustigmatophyceae)、球形或近似球形的單細胞真核生物, 具有較高的光合作用效率、生物量和油脂含量[4]。目前, 對有些微擬球藻株已建立了成熟的大規模封閉式光生物反應器和開放池的戶外培養體系, 多個藻株的全基因組序列業已公布, 遺傳轉化體系也已建立[5—8]。因而, 該屬的種類被認為是最有潛力的工業產油的模式研究藻種[4]。該屬有6個已定種[9], 其中僅有一個種類為淡水類型[10]。盡管利用海洋種類作為微藻生物質原料的生產有許多優勢, 然而, 從污水處理角度考慮利用淡水種類更為合適。迄今, 尚未見對淡水湖泊微擬球藻()產油特性的報道, 也沒有關于其對碳耐受及不同氮源利用效率的研究。本文以湖泊微擬球藻為對象, 分析在不同濃度CO2下, 其對不同類型氮源的利用及油脂與脂肪酸含量, 為利用淡水微擬球藻生產生物能源的同時進行污水及廢氣中氮去除的應用潛力提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藻株和培養

湖泊微擬球藻(KR 1998/3)由德國淡水生態和內陸漁業研究所(Institute of Freshwater Ecology and Inland Fisheries, Neuglobsow)Lothar Krienitz教授提供, 經稀釋涂平板純化后得到無菌藻落。常規培養使用BG11培養基, 在溫度為22℃、光強為60 μmol photons/(m2?s)的連續光照下進行。

三種氮源實驗分別用1 mmol/L的NH4Cl、NaNO2或NaNO3替代BG11培養基中的NaNO3。培養使用內徑為3 cm, 長為60 cm的柱狀玻璃管。接種起始730=0.15, 培養體積為300 mL。培養在通入空氣、2%或5%的CO2(/), 光強約為120 μmol photons/(m2?s)的連續光照條件進行。每天定時取樣測定生長、培養液pH及氮和磷的消耗。

1.2 常規參數測定

通過測定培養液的730值監測藻細胞的生長。藻細胞培養液經離心后用pH計測定pH。培養液中NO2?和NO3?的濃度利用分光光度法(220)檢測[11]。NH4+的測定采用納氏劑-分光光度法(420)[12]。磷酸鹽濃度用磷鉬酸分光光度法測定[13]。

1.3 藻株中性脂含量分析

分別在培養的第2、第4、第6和第8天收集相同數目的藻細胞, 提取總脂, 利用薄層層析法比較總脂的組成及含量。藻細胞的總脂按照Bligh和Dyer[14]的方法提取。經6000 r/min離心收集的藻細胞加入一定體積的氯仿︰甲醇 (1︰1), 在旋渦振蕩器上以最大速度振蕩1—2min, 然后加入3/10體積的1 mol/L氯化鉀的0.2 mol/L磷酸溶液, 稍振蕩后12000 r/min離心5min, 吸取下層氯仿相至新的EP管中, 置于通風櫥中吹干, –20℃保存備用。薄層層析參照文獻[15]進行。薄層層析板的型號是Silica gel 60 F254 (Merk KgaA Darmstadt, Germany), 展層劑體系為正己烷︰乙醚︰乙酸(70︰30︰1,//)。展層完畢從展層缸中取出層析板, 置于通風櫥內吹干展層劑, 然后放置到含有一定量顆粒碘的燒杯中于37℃下顯色5—10min[16]。標準品三油酸甘油酯(Glyceryl trioleate)購自Sigma公司。

1.4 總脂含量的測定及脂肪酸組成分析

6000 r/min離心收集培養8d的藻細胞, 用滅菌ddH2O洗滌三次, 將收集的藻細胞液氮速凍后, 冷凍干燥備用?？傊奶崛〖岸繀⒄瘴墨I[14]。稱取100 mg干藻粉加入一定體積的氯仿: 甲醇 (1︰2) 溶劑萃取充分, 然后加入一定比例的滅菌ddH2O促使分層, 離心收集下層的氯仿層, 轉入已稱重的稱量瓶中, N2吹干有機溶劑, 然后用分析天平稱重, 計算總脂的含量。

總脂甲酯化按如下步驟進行: 將一定量的總脂轉移到1.5 mL Aglient 玻璃瓶中, 加入1 mL 1 mol/L的硫酸甲醇溶液, 充N2后密封, 于100℃反應1h。冷卻后, 加入200 μL 蒸餾水, 混勻后, 以200 μL 正己烷萃取三次, 合并有機相, N2吹干后用正己烷定容至100 μL, 取1 μL 用Ultra Trace 氣相色譜分析儀 (Thermo Scientific, United States) 進行脂肪酸組成分析。色譜柱為毛細管柱(60 m × 0.25 mm); 進樣口溫度為250℃, FID檢測器的溫度為280℃; 實驗采用程序升溫: 150℃, 1min; 150—220℃, 5℃/min; 220—280℃, 20℃/min; 280℃, 33min; 載氣為高純氮, 流速2 mL/min。用面積歸一法計算各脂肪酸組分的相對百分比。

2 結果與討論

2.1 生長

預實驗顯示, 在CO2濃度為5%的條件下, 湖泊微擬球藻的生長即受到明顯的抑制。研究顯示, 其他所有5種海洋微擬球藻在通入5%的CO2時生長并沒有受到促進, 相反一半以上種類的生長被嚴重抑制[17]?？梢? 微擬球藻屬的種類屬于CO2敏感型(不耐受)的類型[18]。在本實驗中, 湖泊微擬球藻在通入2%CO2時(0—0.28/d)的比生長速率均低于通空氣培養條件(0.27—0.29/d)。尤其是在NH4Cl為氮源條件下, 通入2%CO2培養湖泊微擬球藻幾乎不能生長, 培養液的pH維持在6左右(圖1)。研究表明, 在高CO2條件下觀察到光合作用的快速抑制, 是由高CO2壓力下葉綠體間質的酸化引起卡爾文循環的關鍵酶失活所導致的[19]。通空氣培養時培養液的pH為7—8.5, 在通入2%CO2時, 培養液的pH降至6—7.5。以NH4Cl為氮源將使得培養液的pH進一步下降, 圖1的結果也顯示在使用NH4Cl作為氮源的條件下培養液的pH至少低于以NaNO2和NaNO3為氮源條件時1個單位。

以NaNO2為氮源條件下湖泊微擬球藻的生長最佳, 通空氣培養時銨態和硝態氮條件下藻細胞的生長相當。通常認為, 浮游植物具有選擇性利用氮源的特點。硅藻類偏好硝態氮, 而鞭毛藻類則更傾向于還原態氮[20]。NO3?需在硝酸還原酶作用下形成NO2?, 后者再由亞硝酸還原酶還原成NH4+后才可被藻細胞固定。因而, NH4+似乎應是藻類培養的最佳氮源, 許多研究也表明與硝態氮和亞硝態氮比銨態氮更能促進藻類的生長[21, 22]。盡管許多藻類均能利用亞硝態氮, 但過高濃度的亞硝酸鹽對藻有毒害作用[23]。在本實驗中, 在高達1 mmol/L NaNO2條件下湖泊微擬球藻生長仍優于同樣濃度的硝酸鈉培養, 顯示湖泊微擬球藻具有好的亞硝酸鹽耐受性。這一特性暗示可以直接通過培養該藻來處理富含高濃度NOx的煙道氣[24]。

2.2 營養鹽吸收

圖2顯示湖泊微擬球藻對不同氮源的利用情況, 結果顯示對銨態氮的吸收最快, 其次為亞硝態氮, 對硝態氮的吸收最慢。這一結果進一步說明在合適的濃度下, 還原態的銨可以最快地被細胞固定, 而硝態氮由于要經過兩步還原后才能被固定, 所以被吸收得最慢。培養液中的氮濃度隨培養時間在前4天快速下降, 隨后趨于穩定。通常藻細胞可以快速吸收氮源并儲存在細胞中用于細胞分裂[22]。與生長相關, 湖泊微擬球藻對磷的利用在生長前期沒有差別, 后期培養液剩余的磷與生長呈負相關, 生物量越高培養液中磷的濃度越低(圖2)。

2.3 產油特性

與其他藻類不同, 即使在不缺氮條件下微擬球藻也能合成甘油三酯, 它們含有13個二脂酰甘油?；D移酶(DGAT)基因, 其數目是目前已知藻類和植物基因組中最多的, 這也正是微擬球藻屬的種類能大量積累油脂的原因之一[25, 26]。利用薄層層析分析從第2到第8天湖泊微擬球藻總脂組成發現, 第4天即可檢測到大量甘油三酯的積累, 隨后隨培養時間變化甘油三酯含量略有升高(圖3)。而第4天, 藻細胞生長仍然處在對數期, 培養液氮濃度則超過200 μmol/L。即使在培養的第2天, 以硝態氮為氮源條件下也可檢測到少量的甘油三酯。研究顯示, 淡水微擬球藻的甘油三酯含量與海洋的微擬球藻相當[27]。顯然, 中性脂含量的高低與培養條件有密切的關系。由于使用的培養基氮濃度高達17.6 mmol/L, 培養早期收獲檢測到的湖泊微擬球藻僅含很低的甘油三酯[28]。不同氮源對湖泊微擬球藻甘油三酯含量有一定影響, 以亞硝酸鹽為氮源條件下甘油三酯含量高于其他兩種氮源。在2%的CO2濃度培養條件下, 以亞硝酸鹽為氮源與通空氣培養相當, 但在另外兩種氮源培養下則顯著降低。因此從微藻產油角度而言, 亞硝態氮也是湖泊微擬球藻最為合適的氮源。

M. 三油酸甘油酯Triolein

表1 不同氮源下湖泊微擬球藻在通空氣(A)與2%CO2(B)條件下總脂含量(占藻細胞干重)及其脂肪酸組成(摩爾百分比)

將培養8d的湖泊微擬球藻收獲用于分析藻細胞的總脂含量及其脂肪酸組成。表1顯示湖泊微擬球藻的總脂含量為34%—45%, 與海洋微擬球藻的總脂含量相當[27]。在高CO2濃度下藻細胞的總脂含量減少。湖泊微擬球藻脂肪酸組成以C16:0、C16:1和C18:1為主, 三者之和占總脂肪酸的71%—77%。另外兩種含量較高的脂肪酸為C14:0和C20:5。微擬球藻屬的種類均含有高的二十碳五烯酸(EPA), 因而被認為是工業化生產EPA的最佳原料[29]。盡管EPA在該藻中僅為5%—8%, 這與細胞所處的培養期相關, 培養期延長導致的缺氮顯著減少EPA含量[30]。不同氮源培養對幾種短鏈脂肪酸的含量影響不大, 而其多不飽和脂肪酸含量均未超過12%, 豐富而穩定的短鏈脂肪酸組成特點符合作為生物柴油原料的標準。

為將微藻生物質生產與污水處理和廢氣氮去除相結合, 本研究以富含甘油三酯的湖泊微擬球藻為原料, 研究發現該藻最合適的氮源為亞硝態氮。該藻可直接高效利用廢水、廢氣中的氮, 同時積累大量油脂, 是一個在工業上有應用前景的優良藻株。

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EFFECTS OF NITROGEN SOURCES AND CO2LEVELS ON THE GROWTH AND OIL ACCUMULATION IN

LI Feng-juan1, WAN Xiu2, FANG Xian-tao2, HU Rui2, GAO Da-wen1and HU Han-hua2

(1. State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China; 2. Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China)

; Triacylglycerols; Biodiesel; Nitrogen Utilization

10.7541/2015.58

Q948.1

A

1000-3207(2015)02-0436-05

2014-04-30;

2014-08-23

國家重點基礎研究發展計劃項目(2011CB200901)資助

李鳳娟(1982—), 女;黑龍江哈爾濱人; 博士研究生; 主要從事環境生物學研究。E-mail: lifj_hit@163.com

胡晗華, E-mail: hanhuahu@ihb.ac.cn