黃顙魚重組生長激素的制備及對其魚苗生長的影響

姜麗娟 劉文生 林齊鵬 饒飛翔 楊惠暖 王 娟 王 濤 付晶晶

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黃顙魚重組生長激素的制備及對其魚苗生長的影響

姜麗娟1劉文生1林齊鵬2饒飛翔1楊惠暖1王 娟1王 濤1付晶晶1

(1. 華南農業大學動物科學學院, 廣州 510642; 2. 華南農業大學公共基礎課實驗教學中心, 廣州 510642)

生長激素在漁業生產中具有重要的應用價值, 通過制備黃顙魚()同源重組生長激素并用于促生長實驗, 從而為建立魚苗快速培育方法提供理論依據。根據已知黃顙魚生長激素(PfGH)基因cDNA序列, 利用IPTG誘導和SDS-PAGE分析方法, Western印跡表明在IPTG終濃度1.0 mmol/L、溫度17℃和培養時間14h的條件下, 黃顙魚生長激素基因在大腸桿菌中大量表達, 獲得重組生長激素蛋白。然后, 隨機選取黃顙魚分為4組放入室內水族箱中進行養殖, 每箱35尾, 體質量為(0.85±0.01) g, 每組設3個平行, 水體循環凈化。用制備的重組生長激素濃度分別為0、1、5和10 mg/L對黃顙魚進行浸泡處理, 每周一次, 0為對照組。在養殖4周后, 對各組增重率和特定生長率進行比較, 結果表明1 mg/L組增重率和特定生長率分別比對照組提高了29.67% (<0.05)和11.90% (<0.05), 5 mg/L組增重率和特定生長率分別比對照組提高了21.32% (<0.05)和8.83% (<0.05), 各組間體成分等均無明顯差異。停用生長激素4周后, 各組黃顙魚的生長性能、體成分等均無顯著差異。研究表明通過原核表達可以獲得黃顙魚重組生長激素, 用于促進魚苗生長培育的最佳浸泡濃度為1 mg/L。

黃顙魚; 生長激素; 原核表達; 浸泡; 增重率

魚類生長激素(Growth hormone, GH)在水產養殖中的應用已經成為研究熱點, 外源生長激素能被魚類消化道吸收, 硬骨魚類小腸上皮細胞可以通過胞飲作用吸收大分子, 并以具有免疫活性和生物活性的形式進入血液[1—3]。利用自身的GH促進魚類生長, 具有同源性強、效用劑量低等優點[4]。應用基因工程技術合成魚類重組GH(rGH), 不僅解決了魚體內GH量少且提取繁瑣等問題, 而且具有與天然GH相同的生物活性。通過注射[5, 6]、埋植、浸泡[7, 8]、灌喂和投喂[9, 10]等方式將外源GH引入魚體內, 均能引起魚體血漿GH水平升高[11, 12], 促進魚類生長[13—16]。如每2周一次對鯔注射重組黃鰭鯛生長激素, 16周后試驗組的體重和體長增長分別比對照組快65%和22%[17]; 用重組鮭生長激素作為飼料添加劑投喂羅非魚, 具有很強的促進魚體生長作用[10]; 通過注射、灌喂和投喂三種方式將金槍魚基因重組生長激素導入草魚體內, 均能提高草魚魚種的相對體重和相對體長生長率[18]; 用重組鰻生長激素溶液定期浸泡真鯛仔魚, 4周后就能看出明顯的增長效果[7]。另外, 研究表明, 外源GH在魚體半衰期短, 不會產生積累[3], 不會影響魚體組成成分[19]。

黃顙魚()隸屬于鲇形目(Siluri-formes), 鲿科(Bagridae), 黃顙魚屬(), 主要產于長江及支流[20], 我國大部分地區都有分布。因其味道鮮美, 肉質細嫩, 無肌間刺, 且蛋白質豐富, 深受廣大消費者的青睞[21], 是我國重要的經濟魚類之一[22]。由于濫捕及水域環境問題等原因, 野生黃顙魚資源數量銳減, 而市場需求越來越大。然而, 黃顙魚生長速度慢, 1齡可達: 5.6 cm/5.7 g , 2齡: 9.8 cm/20.6 g , 3齡: 13.5 cm/36 g , 4齡: 16 cm/58.2 g , 5齡: 17.8 cm/81.3 g , 最大個體30 cm , (500—750) g[23], 商品魚市場出現供不應求。因此, 本研究選擇原核表達方法制備黃顙魚生長激素重組蛋白, 并用于對黃顙魚魚苗進行浸泡處理, 然后觀察在不同濃度重組生長激素作用下, 幼魚的生長、形態性狀及魚體組成分的變化, 確定最適的浸泡濃度, 為建立黃顙魚魚苗的快速培育技術提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 GH的原核表達

根據已報道的黃顙魚生長激素cDNA ORF序列[24], 去掉20個氨基酸的信號肽序列后, 將成熟肽基因片段定向插入融合表達載體pET-28a(+), 命名為pET-PfGH。根據黃顙魚GH成熟肽cDNA編碼序列設計一對引物, 通過PCR擴增得到黃顙魚生長激素cDNA片段, 上游引物F: 5′-CTGGCTGCCAAGA TGATGGA-3′, R: 5′-TCTCCACCTTGTGCATGTCC- 3′, 由上海捷瑞生物工程有限公司合成。用PCR方法篩選陽性克隆, 上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序, 獲得重組質粒pET-PfGH轉化大腸桿菌BL21(DE3)。培養重組質粒單菌落, 誘導表達, 收集菌體, 裂解菌體。取全菌液、超聲破碎后上清和沉淀分別制樣, 12%的SDS-PAGE進行電泳分析。

1.2 GH的純化回收

將菌體裂解液上清用0.22 μm 過濾器過濾后, 用北京康為世紀生物科技有限公司的5 mL預裝柱, 采用Ni-瓊脂糖凝膠親和層析分離帶His標簽的重組蛋白, 用Binding Buffer (20 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L咪唑, 0.5 mol/L NaCl, pH 7.9)等倍稀釋后負載上柱, 流速為10倍柱體積/h, 收集流穿液; 使用15倍柱體積的Binding Buffer沖洗柱子, 洗去雜蛋白; 依次用含咪唑濃度為5、10、25、50、150、300、400和500 mmol/L 的Elution Buffer (20 mmol/L Tris-HCl, 0.5 mol/L NaCl, pH 7.9)洗脫, 收集洗脫峰, 進行 SDS-PAGE 分析。將洗脫后的蛋白溶液加入到10 kD的Millipore超濾管中, 4℃、4000 r/min離心10min, 棄下部液體, 同時加入與棄液相同體積的生理鹽水, 離心并重復三次, 收集上部液體。

將全菌液、超聲裂解液上清、沉淀和純化后的蛋白Western 印跡分析, 一抗為抗His標簽鼠單克隆抗體, 二抗為HRP標記山羊抗小鼠IgG (H+L), 使用康為世紀BCA蛋白定量試劑盒測定目的蛋白濃度。

1.3 黃顙魚魚苗養殖

實驗魚購自本地養殖場同批全雄黃顙魚魚苗, 隨機選取體質量為(0.85±0.0078) g的魚苗放入80 cm × 60 cm × 50 cm的水族箱中飼養, 每箱35尾。實驗分為4組, 其中對照組1個組, 試驗組3個組, 各組間無差異性, 每組3個平行, 養殖水體保持循環凈化, 連續充氧, 每天換水一次(約1/3), 投餌分上、下午各一次, 日投餌量為魚體重的4%—6%, 飼料購自奧特飼料有限公司。養殖時間從2013年7月6日至2013年8月31日。分別配制黃顙魚重組生長激素溶液濃度為: 0、1、5和10 mg/L, 每周分別對4組魚苗進行浸泡一次, 每次浸泡45min (保持增氧), 飼養4周, 共浸泡4次后, 對照組和試驗組均不作任何處理, 再續養4周。

1.4 采樣及測定

在飼養4周和8周后各采樣一次(采樣前魚禁食24h), 每次每箱隨機選取15尾魚, 隨機取5尾魚測量體長、體重以及肝胰臟等內臟重量, 5尾魚用于全魚體成分分析, 5尾魚用于分子生物學分析, 取肝胰臟于凍存管中, 并迅速放入液氮中, –80℃冰箱保存。

全魚粗蛋白測定采用凱氏微量定氮法, 粗脂肪采用索氏抽提法測定; 粗灰分采用燒灼法(550℃), 水分的測定采用105℃恒溫烘干失重法。

1.5 數據處理

存活率(Survival rate,, %) =100×成活魚尾數/投放魚尾數

增重率(Weight gain rate,, %)=100×(W–0)/0

特定生長率(Special growth rate,,%/d) = 100×(Ln W– Ln0)/

肥滿度(Condition factor,, %)=100×體重/體長3

臟體比(Viscerasomatic index,, %) = 100×內臟重/體重

肝體比(Hepaticsomatic index,, %) = 100×肝重/體重

其中,W、0分別為黃顙魚養殖末均重和養殖初均重,為養殖天數。

數據采用SPSS(V20)軟件進行單因素方差分析 (One-way ANOVA), 差異顯著時(0.05)通過Duncan’s方法進行多重比較, 實驗數據用“平均值±標準誤(Mean± SE)”表示。

2 結果

2.1 黃顙魚GH的制備純化

獲得重組質粒pET-PfGH轉化大腸桿菌BL21 (DE3)后, 涂布在含卡那霉素LB 平板上, 挑取單菌落進行PCR鑒定得到大約424 bp 的片段, 電泳圖譜帶符合預期結果。對獲得的陽性重組子進行 DNA 測序, 結果表明, 黃顙魚GH成熟肽cDNA編碼序列已插入到pET-28a上, 并成功轉移到大腸桿菌BL21中, 將它命名為pET-PfGH-BL21。

pET-PfGH-BL21宿主菌在IPTG誘導前無GH融合蛋白表達, 而誘導后可見一明顯的蛋白帶, 分子量約為21 kD。37℃誘導4h后超聲裂解, 目的蛋白主要存在于沉淀部分, 表明誘導表達的重組GH主要以包涵體形式存在于細胞內。而17℃誘導的目的蛋白在上清和沉淀中均出現, 表明降低溫度可以減少包涵體, 增加可溶性蛋白的產生。

重組生長激素融合多肽采用Ni-瓊脂糖凝膠親和層析。分離純化后的重組GH在SDS-PAGE上表現為單一條帶, 分子量約為21 kD。通過Western Blot檢測, 發現有陽性條帶出現, 其大小與SDS- PAGE中的特異性條帶相符合, 表明在17℃誘導表達全菌液、超聲裂解液上清、沉淀和純化后的蛋白都含有黃顙魚重組GH, 且都具有免疫活性, 經蛋白定量試劑盒檢測獲得蛋白濃度為8.02 mg/mL。經制備純化后的GH蛋白供后續實驗使用。

2.2 重組GH處理對幼魚生長性能的影響

用本實驗制備的重組生長激素浸泡處理黃顙魚魚苗, 養殖4周后, 實驗組魚苗的增重率、特定生長率均比對照組高(表1)。從表1可知, 1 mg/L組、5 mg/L組與對照組之間差異顯著(<0.05), 1 mg/L組最高, 其增重率、特定生長率比對照組分別高出29.67%、11.90%, 各組之間存活率則無顯著差異。停用生長激素4周后, 各組的魚種增重率、特定生長率和存活率均無顯著差異(表2)。

2.3 重組GH對幼魚形態發育的影響

黃顙魚幼魚通過GH浸泡處理并養殖4周后, 對其形態性狀進行測定, 獲得了肥滿度、肝體比、臟體比等指標(表3)。由表3可知, 實驗組的肥滿度與對照組相比沒有顯著差異; 與對照組比較, 試驗組的肝體比均出現下降, 10 mg/L組肝體比顯著低于對照組; 各組之間臟體比沒有顯著差異。而在生長激素停用4周后, 所有各組幼魚的肥滿度、肝體比、臟體比均無顯著差異(表4)。

2.4 重組GH對黃顙魚幼魚體成分的影響

不同GH濃度浸泡對黃顙魚幼魚的水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分均未產生顯著影響(表5)。停用生長激素后各組之間也無明顯差異(表6)。

表1 不同濃度GH浸泡對黃顙魚幼魚增重率、特定生長率和存活率的影響

注: 表中數據為3個重復的平均值。表中同一列標有不同字母的數據表示差異顯著(<0.05); 下同

Note: Data are the means of triplicate. Values with different superscripts have significant differences (<0.05); the same applies bellow

表2 生長激素停用后對黃顙魚幼魚增重率、特定生長率和存活率的影響

表3 不同濃度GH浸泡對黃顙魚幼魚形態發育的影響

表4 生長激素停用后對黃顙魚幼魚形態發育的影響

表5 不同GH浸泡濃度對黃顙魚幼魚體成分的影響

表6 不同GH浸泡濃度對黃顙魚幼魚體成分的影響

3 討論

利用大腸桿菌表達系統進行功能基因的原核表達具有操作簡單, 成本低, 純化工藝成熟等優點[25]。已知黃顙魚cDNA序列的開放閱讀框為603 bp, 編碼長度為200氨基酸的多肽, 其中信號肽為20氨基酸, 成熟肽為180氨基酸。由于魚類GH的信號肽序列不能被大腸桿菌所識別, 因此, 大腸桿菌作為原核表達宿主菌, 在合成基因時應去除編碼GH成熟肽以外的信號肽序列。本研究采用原核融合表達載體pET-28a, 其在外源蛋白兩翼各融合表達1個6×His的標簽, 可用于目的蛋白的純化與鑒定[26], 融合多肽理論估計分子量為21.27 kD, 與SDS-PAGE電泳結果相當。經大腸桿菌表達的魚類GH往往形成包涵體, 通常要進行比較復雜的變性復性處理, 結果可能使蛋白質結構改變, 活性及產量降低。通過摸索誘導溫度, 發現37℃誘導出來的黃顙魚重組蛋白主要是以不溶性的包涵體出現在超聲裂解后的沉淀中, 而17℃誘導的重組蛋白很大部分出現在菌體破碎液上清層, 為可溶性蛋白。利用Ni-瓊脂糖凝膠親和層析、咪唑梯度洗脫、電泳, 獲得了高純度帶His標簽的重組蛋白, 并最終制備了具有生物活性的重組黃顙魚GH。通過浸泡, 外源生長激素可由魚類的口腔、鰓、腸道、皮膚等途徑進入血液, 血漿中的生長激素與肝細胞和腸道的受體結合以后才能發揮促生長生理效應[27—29]。本研究中黃顙魚幼魚1 mg/L組的增重率優于5 mg/L組和10 mg/L組, 1 mg/L外源生長激素的浸泡效果最好, 該組的增重率和特定生長率均最高, 說明外源生長激素用量不是越多越好, 這是因為生長激素的受體數量受限制, 若使用過量的外源生長激素會造成部分激素沒有受體可結合, 反而會反饋性地促進下丘腦分泌生長激素抑制因子, 從而抑制垂體合成釋放生長激素。高劑量的外源生長激素引起的負反應, 從而降低了它可以替補內源生長激素不足進而促進魚體生長的作用。Kayes[30]也曾報道過這種現象和負反應。只有外源生長激素使用適當, 才能取得較好的促生長效果。張慶[18]對草魚、施兆鴻和周一紅[8]對黑鯛稚魚、Agellon等[19]對虹鱒的研究也有相似的報道。因此, 在生產實踐中黃顙魚外源生長激素浸泡用量為1 mg/L較合適。由于通過原核表達獲得大量生長激素的成本高, 而真核表達系統較之大腸桿菌表達系統, 具有表達量高, 外源基因不易丟失、安全性好的優點, 因此, 在實際生產中, 可以采用真核表達方式進行大規模生產生長激素, 使生產成本進一步降低。

有關黃顙魚幼魚體成分的變化, 結果表明實驗組與對照組的水分、粗蛋白、粗脂肪、灰分等物質均無明顯差異, 說明浸泡外源生長激素對黃顙魚粗蛋白、粗脂肪等物質含量沒有影響, Wilson[31]也報道過外源生長激素能促進生長主要表現在刺激脂肪細胞的生長。從本實驗黃顙魚的肥滿度變化結果來看, 外源生長激素對體重和體長的影響同樣明顯, 體長的增長即是骨組織生長, 而體重增加是否包含脂肪成分的變化需要進一步的研究。

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THE PREPARATION OF RECOMBINANT GROWTH HORMONE AND ITS EFFECTS ON THE GROWTH OF JUVENILE IN

JIANG Li-Juan1, LIU Wen-Sheng1, LIN Qi-Peng2, RAO Fei-Xiang1, YANG Hui-Nuan1, WANG Juan1, WANG Tao1and FU Jing-Jing1

(1. College of Animal Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2. Public Basic Course and Experimental Teaching Center, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

In this study, the mature peptide-encoding cDNA sequence of the growth hormone of(PfGH) was inserted into the prokaryote expression vector pET-28a (+). The recombinant plasmid of pET-PfGH was then transfected intoBL21 (DE3) and was induced by IPTG. The SDS-PAGE results showed thatBL21 (DE3) with pET-PfGH expressed a specific fusion protein with a molecular weight of 21 KD. The western blot test revealed that the protein contained a 6-His tag. PfGH was abundantly expressed incultured at 17℃ for 14 hours with the final IPTG concentration of 1.0 mmol/L. After ultrasonic disruption the soluble recombinant protein was reco-vered and purified, and was then applied to juvenile. The subjects with the average weight of (0.85±0.01) g were randomly divided into four groups and were raised in an indoor aquarium. Every group had three repeats with 35 fish in each. The experiments were conducted in the interior circulation water purification system. During the 4-week feeding trial, four groups were soaked in liquid containing the recombinant GH at different concentrations of 0 (the control), 1 (group 1), 5 (group 2) and 10 mg/L (group 3) respectively, and the soaking frequency was once a week. At the end of the trial, our results showed that compared to the control group, the weight gain rate () and the specific growth rate () of group 1 increased by 29.67% (<0.05) and 11.90% (<0.05) respectively; theandof group 2 increased by 21.32% (<0.05) and 8.83% (<0.05) respectively. However, the body composition was not significantly different between the four groups. Furthermore, no significant difference was detected in the growth performance and the body composition between the four groups in 4 weeks after the cease of growth hormone treatment.

; Growth hormone; Prokaryotic expression; Immersion; Weight gain rate

10.7541/2015.36

S961.6

A

1000-3207(2015)02-0275-06

2014-05-09;

2014-09-15

廣東省海洋漁業科技推廣專項(A201101G02, A201301F03); 廣州市農業科技項目(2011)資助

姜麗娟(1986—), 湖北黃石人; 碩士研究生; 研究方向水生生物學。E-mail: 364613168@qq.com

劉文生(1965—), 教授, 博士; E-mail: wsliu@scau.edu.cn