葡萄酒中26種添加劑的高效液相色譜－高分辨質譜篩查法

桂茜雯，柳 菡，許 蔚，龔玉霞，徐牛生，丁 濤，費曉慶，林 宏，趙增運，沈崇鈺，吳 斌，張 睿

（1．江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇南京 210001；2．賽默飛世爾科技（中國）有限公司，上海 201210）

葡萄酒中26種添加劑的高效液相色譜－高分辨質譜篩查法

桂茜雯1，柳 菡1，許 蔚1，龔玉霞1，徐牛生2，丁 濤1，費曉慶1，林 宏1，趙增運1，沈崇鈺1，吳 斌1，張 睿1

（1．江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇南京 210001；2．賽默飛世爾科技（中國）有限公司，上海 201210）

建立了一種高效液相色譜－四極桿／靜電場軌道阱高分辨質譜同時篩查葡萄酒中26種添加劑（包括防腐劑、抗氧化劑、甜味劑和合成著色劑）的方法。葡萄酒經甲醇－水溶液（1∶9，V／V）稀釋后，采用超高效C18柱分離，高分辨質譜全掃描模式提取目標化合物的精確質量數，外標法定量。在0．1～5mg／L范圍內，26種添加劑的線性關系良好，線性相關系數均大于0．99。干紅葡萄酒和干白葡萄酒基質中，2、4、20mg／kg 3個添加水平的回收率均在78．5％～118．8％之間，相對標準偏差小于12．7％，定量限為2mg／kg。該方法的前處理快速、簡單，高分辨質譜定量結果的準確度和精密度高，可用于葡萄酒中添加劑的篩查。

四極桿／靜電場軌道阱高分辨質譜；高效液相色譜；葡萄酒；添加劑

國家食品添加劑使用標準GB 2760—2011和葡萄酒國家標準GB 15037—2006，都對葡萄酒中添加劑的使用做出了明確的規定，即葡萄酒中不得添加合成著色劑、甜味劑、香精和增稠劑，并規定苯甲酸的限量為50mg／kg，山梨酸的限量為200mg／kg。美國FDA和歐盟食品添加劑標準中也對山梨酸有相同的限量要求。但葡萄酒市場依然有不少違規使用添加劑或者添加劑超標的現象，例如防腐劑、甜味劑和著色劑等添加劑超標，甚至有不法商販利用酒精、水和著色劑、甜味劑、香精等添加劑進行勾兌，假冒名牌葡萄酒或者冒充自制葡萄酒出售，擾亂了葡萄酒市場，危害消費者健康。

目前，針對葡萄酒中添加劑的檢測方法有高效液相色譜法［1－2］、氣相色譜法［3］、氣相色譜－質譜聯用法［4－5］、高效液相色譜－質譜聯用法［68］、毛細管電泳法［9］和離子色譜法［10］等。針對不同種類的添加劑，以上文獻報道了不同的前處理和儀器檢測方法，但均存在有機溶劑用量大、耗時長和耗材較多等問題。陳曉紅等［7］對葡萄酒中9種防腐劑和甜味劑進行LCMS／MS檢測方法研究，并闡述了質譜裂解途徑；馮峰等［6］介紹了檢測葡萄酒中14種添加劑的LC－MS／MS方法，并探討了色譜分離中緩沖液的濃度對質譜檢測靈敏度的影響。這2篇文獻均采用低分辨質譜檢測添加劑，無法對其他添加劑進行篩查分析，有一定的局限性。黎永樂等［8］采用液相色譜－線性離子阱／靜電場軌道阱高分辨質譜檢測葡萄酒中15種合成色素，用二級質譜比對定性，同時進行未知物的篩查，但由于采用WAX小柱前處理富集凈化，并用苯基柱分離，無法檢出葡萄酒中其他類型的添加劑。而高效液相色譜－四極桿／靜電場軌道阱質譜可以檢測目前常見的多種防腐劑、甜味劑和著色劑等添加劑，并且可以同時完成已知添加劑的測定和未知添加劑的篩查。

本研究選用甲醇－水溶液稀釋葡萄酒，高效液相色譜－四極桿／靜電場軌道阱高分辨質譜法快速篩查葡萄酒中26種添加劑，采用全掃描模式測定，通過提取一級質譜精確質量數進行定性定量分析，以期建立檢測葡萄酒中添加劑的快速篩查方法。

1 實驗部分

1．1 儀器、試劑和材料

四極桿／靜電場軌道阱高分辨質譜儀QExactive：美國Thermo－Fisher公司產品，配有H－ESIⅡ源；液相色譜系統：Dionex 3000高壓液相色譜，帶自動進樣器；KH－500B超聲儀：昆山禾創超聲儀器有限公司產品；ELGA－Q15高純水發生器：英國Elga公司產品。

苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、丁基羥基茴香醚、2，6－二叔丁基對甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜、阿斯巴甜、三氯蔗糖、甜菊糖苷、紐甜、檸檬黃、日落黃、誘惑紅、莧菜紅、麗春紅4R、赤蘚紅、偶氮玉紅、熒光桃紅、亮藍和新紅等添加劑標準品（純度均不小于90％）：美國Sigma和Dr．Ehrenstorfer公司產品；甲醇、醋酸銨和甲酸（色譜純）：德國Merck公司產品；實驗用水為去離子水。

1．2 溶液的配制

標準儲備液的配制：分別準確稱取100mg標準品于10mL容量瓶中，用甲醇－水溶液（3∶7，V／V）溶解，定容，配制成10g／L標準儲備液，于4℃冷藏。

混合標準工作溶液的配制：準確量取適量的標準儲備液，用甲醇－水溶液（3∶7，V／V）逐級稀釋，得到10mg／L混合標準工作溶液，于4℃冷藏。

1．3 樣品前處理

準確稱?。?±0．01）g葡萄酒樣品于10mL

容量瓶中，加入5mL甲醇－水溶液（1∶9，V／V），渦旋后超聲5min，冷卻至室溫，定容，加蓋混勻。吸取部分溶液轉移至進樣瓶中，供儀器測定。

1．4 儀器條件

1．4．1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Kinetex C18柱（100mm×4．6mm×2．6μm）；流動相：甲醇（A），5mmol／L醋酸銨水溶液（B）；流速0．40mL／min；柱溫：室溫；進樣體積10μL；分析時間13min；梯度洗脫程序列于表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution program

1．4．2 質譜條件 加熱源溫度300℃，毛細管溫度350℃，噴霧電壓3 000V（負離子模式），質量掃描范圍m／z 100～1 000，一級質譜全掃描分辨率35 000，C－trap最大容量（AGC）3× 106，C－trap最長等待時間200ms。

2 結果和討論

2．1 前處理方法的優化

為減少提取和凈化過程中添加劑的損失，擬將葡萄酒樣品用甲醇－水溶液（1∶9，V／V）稀釋，過針式濾膜，直接進樣分析。實驗發現，添加回收樣品過尼龍濾膜后，濾膜上留有顏色，且部分著色劑的回收率顯著降低，推測該濾膜對著色劑有吸附和阻擋作用。因此，本研究考察了混合纖維素（MCM）、尼龍（Nylon）、親水型聚四氟乙烯（PTFE）、聚偏氟乙烯（PVDF）和聚醚砜（PES）等5種材質的濾膜對著色劑回收率的影響。通過加標回收實驗發現：MCM和Nylon濾膜對著色劑基本完全吸附，幾乎無回收；PTFE和PES的吸附作用最小，但對赤蘚紅和熒光桃紅B這兩種分子質量較大的物質仍損失50％以上。而不過濾膜直接進樣時，各添加劑的回收率均在80％～120％之間，無明顯的基質效應。因此，確定前處理方法為樣品在稀釋后不過濾膜，直接進樣分析。

2．2 色譜條件的優化

馮峰等［6］同時檢測多種甜味劑和著色劑，陳曉紅等［7］同時檢測多種防腐劑和添加劑，兩篇文獻均采用C18色譜柱分離；而黎永樂［8］等則選用了苯基色譜柱檢測性質相似的著色劑。本研究需同時檢測多種性質不同的添加劑，因此采用高效C18色譜柱進行方法開發。

實驗比較了幾種有機相和水相的組成，有機相主要考察了乙腈和甲醇，水相主要考察了純水和5mmol／L醋酸銨水溶液。由于采用負離子模式檢測，流動相中加入酸會抑制負離子的形成，所以不對添加酸的流動相進行考察。

實驗發現，使用乙腈作為流動相時，苯甲酸、山梨酸和脫氫乙酸等酸性化合物的峰形較差，拖尾嚴重，且脫氫乙酸由于峰形寬，造成信噪比低，在濃度為100μg／L時已無法檢出，無法滿足檢測靈敏度的要求。改用甲醇作流動相后，各類酸性化合物的峰形明顯改善，信噪比提高，其他化合物則無明顯影響。

使用純水作為流動相時，較高濃度標準溶液的峰形不佳，在水中加入5mmol／L醋酸銨后，高濃度標準溶液的峰形明顯改善，且分離效果更好。莧菜紅和麗春紅4R是同分異構體，在該色譜條件下，能有效的基線分離，莧菜紅在4．77min出峰，麗春紅4R在5．10min出峰，其離子流圖示于圖1。因此，本實驗最終采用甲醇－5mmol／L醋酸銨水溶液作為流動相。

2．3 質譜條件的優化

本研究分析的添加劑或含有羥基（—OH），或以K＋、Na＋鹽形式存在，在極性溶劑中，易失去H＋、K＋、Na＋等離子，形成帶負電荷的基團，適合在負離子模式下檢測。

含—OH的苯甲酸、山梨酸、丁基羥基茴香醚、2，6－二叔丁基對甲酚、阿斯巴甜、三氯蔗糖、甜菊糖苷、紐甜和對羥基苯甲酸酯類等添加劑失去H＋，形成［M－H］－離子。含Na＋或K＋的甜蜜素、糖精鈉和安賽蜜，在失去所有Na＋或K＋后，無位點或部分位點與H＋結合，最終形成［M－mNa（K）＋nH］（m－n）－離子。其中，m

指化合物含有的所有Na＋或K＋的個數，n指該化合物電離后，H＋與失去Na＋或K＋的位點結合的個數；m－n為該離子攜帶的電荷數；質荷比（m／z）為化合物電離后形成的離子質量與所帶電荷的比值。

圖1 標準溶液中莧菜紅和麗春紅4R的選擇離子流圖Fig．1 Extract ion chromatogram of Amaranth and Ponceau 4R in standard solution

以全掃描模式進樣分析，對得到的總離子流圖提取所有可能產生的離子質荷比，發現大部分含多個Na＋或K＋的化合物都會同時產生多個離子。本研究主要選取m／z響應最高的作為定量離子。

莧菜紅和麗春紅4R是同分異構體，進單標分析時發現，二者的保留時間略有不同，但都會形成［M－3Na＋H］2－離子m／z267．982 70。另外，莧菜紅還單獨形成［M－3Na］3－離子m／z 178．318 71，其響應值比m／z 267．983 52略低?？紤]到定性的特異性，以m／z 178．318 71作為莧菜紅的定量離子，m／z 267．983 52作為麗春紅4R的定量離子。

由于本方法利用一級質譜進行篩查，依靠提取精確質量數進行定性，因此理論質量數與實際測得的質量數相對偏差越小，篩查結果的可信程度越高。由于高分辨質譜為新開發儀器，目前暫無準確的定性偏差指標，所以，本實驗規定，化合物實測質荷比與理論質荷比相差不超過±1×10－5，即可認定為相同物質，陽性樣品可與標準物質比對保留時間和精確質量數來進行進一步的定性定量分析。葡萄酒中26種添加劑的理論質荷比和實測質荷比列于表2。由表2中數據可以看出，二者的相對偏差均小于5×10－6，說明該結果有效可靠。同時，表2中也列出了分子式、分子離子峰質荷比和理論精確質量數等信息。

結合全掃描模式檢測實際樣品所獲得的譜圖，對新發現的非法添加物可以通過提取其精確質量數進行篩查，有利于追溯工作的展開和數據收集。

表2 26種添加劑信息表Table 2 Information table of 26 kinds of additives

續表2

2．4 線性范圍、定量限、回收率和精密度

以標準品峰面積為縱坐標，工作溶液濃度（μg／L）為橫坐標，繪制標準工作曲線（0．1～5mg／L，標準曲線權重為1／x），26種添加劑的線性相關系數r均大于0．99。以26種添加劑譜峰的信噪比S／N＝3時的進樣濃度為檢出限，檢出限范圍在0．05～50μg／L，結果列于表3。根據其中靈敏度最低物質的信噪比進行添加回收，確定方法的定量下限（S／N＝10）為2mg／kg。在陰性干白葡萄酒和干紅葡萄酒樣品中添加26種添加劑的標準溶液，添加水平為2、4和20mg／kg，每個添加水平平行測定6個樣品，平均回收率在78．5％～118．8％之間，精密度為1．5％～12．7％，結果列于表3。其中，陰性干紅葡萄酒樣品中添加2mg／kg的26種添加劑的選擇離子流圖示于圖2。

2．5 實際樣品檢測

對來自法國、意大利、澳大利亞、西班牙和中國等國家不同產地的50余份葡萄酒樣品進行分析，共檢出山梨酸陽性樣品2個，檢出值分別為130．4mg／kg和100．9mg／kg；安賽蜜陽性樣品1個，檢出值為3．2mg／kg；誘惑紅陽性樣品1個，檢出值為16．1mg／kg；麗春紅4R陽性樣品1個，檢出值為17．3mg／kg；亮藍陽性樣品1個，檢出值為5．2mg／kg；其余樣品均沒有檢出。

圖2 陰性干紅葡萄酒中添加2 mg／kg的26種添加劑的選擇離子流圖Fig．2 Extract ion chromatogram of a blank dry red wine spiked 26 kinds of additives（2 mg／kg）

表3 干紅葡萄酒中26種添加劑的加標回收率和精密度（n＝6）Table 3 Recoveries and precisions of 26 kinds of additives spiked in blank dry red wine（n＝6）

3 結論

本研究利用高效液相色譜－四極桿／靜電場軌道阱高分辨質譜快速篩查葡萄酒中26種添加劑。該方法快速、準確，高分辨質譜在樣品分析中消除了基質干擾，提高了分析定性的準確性，方法的定量限可滿足國內外對添加劑限量的要求，且能夠應用于未知物篩查，有利于追溯工作的展開。

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Screening of 26 Kinds of Additives in Wines by High Performance Liquid Chromatography－High Resolution Mass Spectrometry

GUI Qian－wen1，LIU Han1，XU Wei1，GONG Yu－xia1，XU Niu－sheng2，DING Tao1，FEI Xiao－qing1，LIN Hong1，ZHAO Zeng－yun1，SHEN Chong－yu1，WU Bin1，ZHANG Rui1
（1．Jiangsu Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing210001，China；2．Thermo Fisher Scientific，Shanghai 201210，China）

The method for screening of 26kinds of additives in wine was developed by liquid chromatography－quadrupole／orbitrap high resolution mass spectrometry．The additives were separated by C18high performance column after the wines were diluted by methanol－water mixtures（1∶9，V／V）．This method was quantitatived by external standard method using full scan mode of high resolution mass spectrometer extracting accurate mass extraction of the target compound．Good linearity is obtained in the range of 0．1－5mg／L for 26kinds of additives with the linear correlation coefficients greater than 0．99．Satisfactory recoveries range from 78．5％to 118．8％at three levels of 2，4

quadrupole／orbitrap high resolution mass spectrometry；high performance liquid chromatography；wines；additives

O657．63

A

1004－2997（2015）02－0148－08

10．7538／zpxb．2015．36．02．0148

2014－03－17；

2014－09－01

國家質量監督檢驗檢疫總局科技計劃項目（2013KJ41，2012KJ31，2012BAK08B01）資助

桂茜雯（1985—），女（漢族），江蘇南京人，工程師，食品科學與工程專業。E－mail：wendy＿gqw＠aliyun．com

and 20mg／kg are gained in dry red and white wines with the relative standard deviation less than 12．7％．The limit of quantitation（LOQ）is 2mg／kg．This method is suitable for screening of 26kinds of additives in wines by its fast and simple preprocessing with high accuracy and precision of high resolution mass spectrometry．