動物源食品中β受體阻斷劑殘留量測定的不確定度評定

許 輝，張鴻偉，張 罡，王鳳美

（山東出入境檢驗檢疫局，山東青島 266002）

動物源食品中β受體阻斷劑殘留量測定的不確定度評定

許 輝，張鴻偉，張 罡，王鳳美

（山東出入境檢驗檢疫局，山東青島 266002）

建立了液相色譜－串聯質譜（LC－MS／MS）法測定動物源食品中β受體阻斷劑殘留量的數學模型，依據影響測量結果的不確定度來源，如標準溶液配制、樣品稱量、回歸方程、方法重復性等，對各個不確定度分量進行評定和分析，給出了0．5μg／kg檢測水平下，液相色譜－串聯質譜法測定食品中β受體阻斷劑殘留量的相對合成標準不確定度以及擴展不確定度。通過比較各分量不確定度，發現實驗過程中最小二乘法擬合帶來的不確定度影響最大。

不確定度；β受體阻斷劑；液相色譜－串聯質譜（LC－MS／MS）

不確定度是表征合理地賦予被測量值的分散性，與測量結果相聯系的參數［1］。一個完整的測量結果，除了給出被測量的最佳估計值之外，還應同時給出測量結果的不確定度。建立和實施各類檢測的不確定度評定方法，既是提高檢測質量的要求，也是實現檢測數據國際互認所不可缺少的內容［2－9］。

β受體阻斷劑是能選擇性地與β腎上腺素受體結合，從而拮抗神經遞質和兒茶酚胺對β受體激動作用的一種藥物類型。受體阻斷劑具有負性變時、變力作用，可引起心動過緩、房室傳導阻滯，誘發心力衰竭或心功能惡化，使白細胞減少，血尿酸升高［10－16］。目前，液相色譜－串聯質譜法（LC－MS／MS）測定動物源食品中β受體阻斷劑殘留量的不確定度評定尚未見報道。

本工作按照JJ1059－2012規定，對液相色譜－串聯質譜法測定動物源食品中β受體阻斷劑殘留量的不確定度來源進行分析。根據所建立的數學模型，對各個分量的不確定度進行評估，得到本實驗的不確定度，以便為科學地評定測量結果提供依據。

1 實驗部分

1．1 主要儀器與試劑

Agilent 1290液相色譜系統：美國Agilent公司產品；API 5500三重四極桿質譜分析儀：美國AB Sciex公司產品；T25basic高速均質器、渦旋混勻器、HS260basic水平振蕩器：德國IKA公司產品；CR22GⅡ高速冷凍離心機：日本日立公司產品；Turbo Vap LV型氮吹濃縮儀：美國Caliper公司產品。

阿替洛爾、美托洛爾、卡拉洛爾、卡拉洛爾－D7、比索洛爾：均為德國Dr．Ehrenstorfer公司產品；阿替洛爾－D7、吲哚洛爾、吲哚洛爾－D7、美托洛爾－D7、醋丁洛爾－D5、比索洛爾－D5、拉貝洛爾：均為加拿大TRC公司產品；普萘洛爾：美國Sigma公司產品；普萘洛爾－D9：加拿大CDN公司產品；噴布洛爾：EDQM公司產品；噴布洛爾－D9：德國Witega公司產品；醋丁洛爾：美國Fluka公司產品；甲酸（色譜級）：美國Riedel－de Haen公司產品；甲醇、乙腈、正己烷（色譜級）：B＆J Brand公司產品；實驗用水：由Millipore系統制得的超純水。

1．2 樣品前處理

稱?。?．00±0．01）g粉碎均勻的試樣，置于50mL離心管中，分別加入40μL 0．1mg／L混合內標溶液、40μL酶解液和5mL EDTA提取液，渦旋混勻1min，高速均質器均質，置于50℃水浴振蕩器中恒溫振蕩60min，調節pH值。分別加入2g硅藻土、2g NaCl和25mL乙腈，振蕩10min，以10 000r／min離心10min，移取上清液，過凈化填料，渦旋混勻1min，振蕩5min，以10 000r／min離心5min，移取5mL上清液于40℃下氮氣吹干。用1mL甲醇－0．2％甲酸水（1∶9，V∶V）復溶，過0．22μm濾膜，供液相色譜－串聯質譜儀測定。

2 不確定度評定

2．1 數學模型

根據內標法，測量計算公式如下：

式中：X為試樣中待測組分的殘留量（μg／kg）；C為標準工作溶液的濃度（μg／L）；Cis為標準工作溶液中內標物的濃度（μg／L）；Ci為樣液中內標物的濃度（μg／L）；A為樣液中待測目標物的峰面積；As為標準工作溶液中目標物的峰面積；Ais為標準工作溶液中內標物的峰面積；Ai為樣液中內標物的峰面積；V為樣品定容體積（mL）；m為樣品稱樣量（g）。

實驗中，標準工作溶液中內標物濃度Cis和樣液中內標物濃度Ci帶來的不確定度，以及峰面積A、As、Ais、Ai的不確定度，可以并入到由標準曲線求得的樣液中待測物與其同位素內標物的質量濃度比x0中；frep為測量重復性影響因素的修正因子，其值為1，因此式（1）可改為：

2．2 不確定度來源

從測量過程和數學模型分析，樣品測定的不確定度來源主要有：標準溶液配制引入的不確定度urel（C）；標準曲線校準引入的不確定度urel（x0）；樣品稱量引入的不確定度urel（m）；樣品溶液添加、稀釋和定容引入的不確定度urel（V）；結果重復性引入的不確定度urel（frep）。不確定度來源示意圖示于圖1。

圖1 不確定度來源示意圖Fig．1 The schematic of uncertainty source

上述各參數影響相互獨立，因此其相對合成標準不確定度urel（X）可表征為以上5項不確定度的平方和再開二次方。

2．3 各分量不確定度的計算

2．3．1 標準溶液配制引入的不確定度urel（C）

準確稱取各約10mg 9種標準品，分別移入10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配成1 000mg／L標準儲備溶液；從中分別移取100μL于10mL容量瓶中，用甲醇定容，得到濃度為10mg／L混合標準中間液；從混合標準中間液中移取100μL于10mL容量瓶中，用甲醇定容，得到濃度為100μg／L混合標準工作液。按如上操作，稱取一定量的內標標準品，分別獲得濃度為1 000mg／L、10mg／L、100μg／L內標混合溶液。

標準溶液的配制包括β受體阻斷劑類標準溶液的配制和β受體阻斷劑類內標溶液的配制，因此標準溶液的相對標準不確定度為：urel（C）＝以吲哚洛爾為例，其標準溶液引入的不確定度評定如下：

1）標準溶液配制引入的不確定度

（1）吲哚洛爾純度為98．0％，其相對不確

（2）標準品稱量使用萬分之一天平，精確至0．1mg。天平校準證書給出的不確定度為0．17mg，k＝2，則校準產生的標準不確定度為u1（w）＝0．17／2＝0．985mg；利用《化學分析中不確定度的評估指南》［7］附錄G中給定的數據，對十萬分之一分析天平最后一位有效數字為0．01mg，則由天平重復性產生的不確定度為u2（w）＝0．5×0．01＝0．05mg。標準品稱樣量為10．2mg，因此，標準品稱量帶來的相對標準不確定度為0．008 35。

（3）標準品配制所使用的10mL A級容量瓶20℃時的容量允差為±0．020mL，服從三角分布，區間半寬度此引起的標準不確定度u1（V10）＝a（V10）／k＝0．008 17mL；實驗室溫度在（20±5）℃之間變動，甲醇的膨脹系數（20℃）為0．001 18／℃，對10mL容量瓶由溫度效應產生的體積變化ΔV＝10×5×0．001 18＝0．059mL，服從均勻分布，由此引起的標準不確定度u2（V10）＝a／k＝0．034 1mL，故：

其相對標準不確定度urel（V1）＝u（V10）／V10＝0．003 52。

使用100μL移液槍稀釋標準溶液，其容量允差為±1．0μL，服從均勻分布，由此引入的標準不確定度為u1（V100）＝a1（V100）／k＝0．057 8μL；由溫度效應產生的體積變化ΔV＝100×5×0．001 18＝0．590μL，服從均勻分布，，故稀釋過程中使用移液槍引入的標準不確定度為稀釋過程中，使用10mL容量瓶和移液槍各2次，其中，10mL容量瓶的合成標準不確定度為u（V10）＝0．035 2mL，移液槍移取的體積均為100μL，故標準溶液稀釋過程引入的相對標準不確定度為：

由此，標準溶液配制、稀釋過程引入的相對標準不確定度為：

綜上，吲哚洛爾標準溶液配制引入的相對標準不確定度為：

2）內標溶液配制引入的不確定度

（2）吲哚洛爾－D7稱量引入的不確定度計算過程與標準溶液引入的不確定度相同，稱樣量為10．3mg，故其相對合成標準不確定度urel（w）＝

（3）吲哚洛爾－D7溶液配制和稀釋過程中，相對不確定度計算與標準溶液的計算方法相同，其值分別為urel2（V1）＝0．003 52、urel2（V2）＝0．006 94；實驗過程中，使用100μL移液槍添加內標溶液，移液槍引入的標準不確定度為u（V100）＝0．671μL，樣品前處理過程中內標溶液的移取體積為40μL，故內標溶液添加引入的相對標準不確定度為urel（V3）＝0．671／40＝ 0．016 8。

由此，內標配制、稀釋、添加過程引入的相對標準不確定度為：

故吲哚洛爾－D7內標溶液配制引入的相對標準不確定度為：

標準溶液配制引入的相對標準不確定度為：

9種β受體阻斷劑類藥物標準溶液引入的相對不確定度列于表1。

2．3．20．2、0．5、0．8μg／L，其內標濃度均為0．08μg／L。對β受體阻斷劑類藥物與其內標質量濃度比x0分別為0、0．125、0．25、0．5、1．0、2．0、5．0、10．0的8個校準溶液各平行測定3次，得到相應的標準物質與內標物質峰面積比值y；對以上測定數據采用最小二乘法進行擬合，得到校準曲線方程y＝bx＋a和擬合系數r2，相關結果列于表2。

表1 標準溶液引入的相對不確定度Table 1 The relative uncertainty of standard solutions

續表2

為了評定最小二乘法估計量的不確定度，首先必須對直接測量所得的測量數據進行不確定度估計，實際上是求出測量數據的實驗標準差：

式中，［yi，j－（a＋bxj）］為當輸入量為xj時，儀器響應值與擬合直線上對應的響應值之差。

使用間接式測量儀器測量時，利用校準曲線，在測得樣品響應值y0后，可按線性回歸方程計算被測量的預估值x0，其標準不確定度為：

式中，s（y）為校準溶液峰面積比殘差的標

準偏差；b為擬合直線的斜率；p為樣品平行測量次數，本例為6；n為擬合直線的數據對總數，本例為24；x0為樣品平行測量P次結果的平均值；ˉx為繪制擬合直線全部（n個）輸入值x1的總平均值，urel（x0）＝u（x0）／x0，計算結果列于表3。 2．3．3 樣品稱量引入的不確定度 使用百分之一天平稱量樣品，稱樣量為2．00g，精確至0．01g。天平校準證書給出的不確定度為0．005 80g，k＝2，故u（m）＝0．005 80／2＝0．002 90g，其相對標準不確定度為urel（m）＝u（m）／m＝0．001 45。

表3 標準曲線引入的不確定度Table 3 The uncertainty of standard curve

2．3．4樣品溶液添加、稀釋和樣品定容引入的不確定度 實驗過程中，使用25．0mL可調加液器添加乙腈提取液。容量允差為±100．0 μL，服從均勻分布mL；由溫度效應產生的體積變化為ΔV＝ 0．171 2mL，服從均勻分布，其相對標準不確定度urel（V1）＝u（V10）／V10＝0．011 5。

實驗過程中，使用5．0mL移液槍移取氮吹濃縮的5mL樣品溶液。移液槍的容量允差為±50．0μL，服從均勻分布28．9μL；由溫度效應產生的體積變化為ΔV＝ 34．25μL，服從均勻分布，其相對標準不確定度為urel（V2）＝u（V5000）／V5000＝0．011 5。

樣品定容使用1 000μL移液槍，其容量允差為±10．0μL，服從均勻分布，u1（V1000）＝a（V1000）／k＝5．78μL；實驗室溫度引起的體積變化可以忽略不計，故urel（V3）＝u（V1000）／V1000＝0．005 78。

綜上，樣品溶液添加、稀釋和樣品定容引入的不確定度為：

2．3．5 結果重復性引入的不確定度 在重復性條件下，對樣品進行了n次獨立測試（n＝6）。以吲哚洛爾為例，平行測定結果分別為：0．494、0．574、0．581、0．465、0．508、0．477μg／kg，平均值為根據貝塞爾公式計算得單次測量的標準不確定度u（X）＝

以多次測量結果的算術平均值為最佳估算值，則測定結果的標準不確定度u（ˉX）＝s（ˉX）＝由此引起的結果重復性引入的相對標準不確定度0．039 1。由結果重復性引入的9種β受體阻斷劑類藥物的相對標準不確定度列于表4。

表4 結果重復性引入的相對標準不確定度Table 4 The relative uncertainty of repeatability of results

3 樣品合成標準不確定度、擴展不確定度

由2．2節求得各物質的相對合成不確定度，則合成標準不確定度u（X）＝X×urel（X）；取包含因子k＝2，置信概率p＝95％，求得擴展不確定度為U（X）＝k×u（X），具體結果列于表5。

表5 9種β受體阻斷劑類藥物的不確定度Table 5 The uncertainty of 9 kinds of beta－blockers

4 結論

本工作采用液相色譜－串聯質譜法對食品中9種β受體阻斷劑的殘留量進行測定，比較各分量不確定度大小，發現實驗過程中最小二乘法擬合帶來的不確定度影響最大；標準溶液的配制、進樣過程、儀器響應和測量的重復性對不確定度有一定的貢獻，而樣品稱量的不確定度可以忽略不計。

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Uncertainty Evaluation in the Determination of β－Blockers in Food of Animal Origin

XU Hui，ZHANG Hong－wei，ZHANG Gang，WANG Feng－mei
（Shandong Entry－Exit Inspection Quarantine of the People’s Republic of China，Qingdao 266002，China）

β－Blockers in food of animal origin was determined by liquid chromatographytandem mass spectrometry（LC－MS／MS）．According to the mathematic model，the uncertainty sources of test results were analyzed，such as the standard solution preparation，sample weighing，regression equation，method repeatability．Each component uncertainty was calculated through analyzing．With the limits of quantification of 0．5μg／kg for all analytes，the expanded uncertainty was calculated while the combined standard uncertainty ofβ－blockers residue was obtained．Comparing of each component of uncertainty in the process，the results show that the effect of the least squares fitting is the maximun．

uncertainty；β－blockers；liquid chromatography－tandem mass spectrometry（LC－MS／MS）

O657．63

A

1004－2997（2015）02－0185－08

10．7538／zpxb．youxian．2014．0062

2014－03－16；

2014－07－07

國家質檢總局科技項目（2007IK144）；山東省科技發展計劃項目（2008GG10009020）；山東出入境檢驗檢疫局科研攻關項目（SK200820）資助

許 輝（1982—），男（漢族），工程師，從事藥物殘留檢驗研究。E－mail：xh2k12＠sohu．com

時間：2014－12－02；

http：∥www．cnki．net／kcms／doi／10．7538／zpxb．youxian．2014．0062．html