超臨界CO2萃取香榧假種皮提取物的工藝優化及其主要成分分析

于勇杰 韓 琴 倪 穗 鄔玉芬 桑衛國

（寧波大學海洋學院1，寧波 315211）

（寧波市寧?？h林特技術推廣總站2，寧海 315600）

超臨界CO2萃取香榧假種皮提取物的工藝優化及其主要成分分析

于勇杰1韓 琴1倪 穗1鄔玉芬2桑衛國1

（寧波大學海洋學院1，寧波 315211）

（寧波市寧?？h林特技術推廣總站2，寧海 315600）

采用響應面法優化了超臨界CO2流體萃?。⊿CE）香榧假種皮提取物的工藝，并采用氣相色譜質譜聯用儀（GC－MS）對其提取物成分進行了分析。在單因素試驗的基礎上，選取動態萃取時間、萃取溫度、萃取壓力作為變量，以香榧假種皮提取物得率為指標，采用Box－Behnken試驗設計方法進行三因素三水平試驗，根據回歸方程的預測模型對結果進行響應面分析，確定超臨界CO2流體萃取香榧假種皮提取物的優化工藝為：粉碎度40目，靜態萃取時間20min，動態萃取時間2.5 h、萃取溫度45℃、萃取壓力34 MPa，在此條件下提取物平均提取率為（22.12±0.09）%。經過GC－MS檢測分析，香榧假種皮提取物的主要成分為二萜類物質，其次為羧酸、酯類、倍半萜類和單萜類物質。

超臨界CO2萃取 香榧假種皮 響應面法 氣相色譜質譜聯用儀

香榧（Torreya grandis cv．merrillii）屬紅豆杉科（Taxaceae）榧屬（Torreya Arn.）裸子植物，第三紀孑遺植物，雌雄異株，常綠喬木，又稱榧子、玉榧、細榧、赤果等，在我國浙江、安徽、江蘇、福建等省份丘陵地區均有栽培［1］。香榧是我國特有的珍稀干果和優質高產的木本油料作物，具有材用、藥用、果用、油用和觀賞、綠化等多種用途。

香榧的種子香脆可口、營養豐富，含有豐富的礦物質、維生素、蛋白質，種仁含油率為60%左右，其中不飽和脂肪酸含量達80%以上［2－3］。香榧還具有殺蟲消積、潤肺化痰、滑腸消痔、健脾補氣、去瘀生新等藥用價值，《本草綱目》、《本草推陳》、《中國藥典》等著作對其藥用價值均有記載［4］。香榧種子外部有一層假種皮是不能食用的，約占種實鮮重的50%，目前尚未得到有效的開發利用。據報道，香榧假種中富含二萜類、揮發油、黃酮等活性成分［5－6］。其中揮發油和二萜類物質是制備高級芳香油和浸膏的天然原料，紫杉醇和榧黃素具有抗病毒和抗腫瘤的功效［7－8］。因此將香榧假種皮作為提取天然活性物質的原料，具有極大的應用價值和開發前景。

超臨界流體萃?。⊿upercritical Fluid Extraction，SFE）技術是近年來發展起來的一項新型萃取和分離技術。由于CO2的超臨界溫度低、無色、無毒、無味、不易燃燒、易制成高純度氣體、價格低廉，且具有較好的溶劑特性［9］，因此 CO2是首選的超臨界流體。超臨界 CO2流體萃?。⊿upercritical Carbon Dioxide Extraction，SCE）的天然產物具有較好的提取、分離效果，目前已被廣泛應用于天然產物如植物油、香辛香料等天然有效成分的提?。?0－12］。本研究采用超臨界CO2流體萃取香榧假種皮活性成分，在單因素試驗的基礎上，利用響應面法（Response Surface Method，RSM）對香榧假種皮中主要物質的提取工藝條件進行優化，并采用GC－MS對提取物主要成分進行分析。以期為香榧假種皮中這些有效物質在醫藥、日用化學品和食品工業中的利用提供技術方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗材料：成熟的香榧種子于2013年9月采自浙江寧海榧坑村香榧生產基地20年左右樹齡的樹上。從成熟的香榧種子上剝離下假種皮，在避光條件下自然陰干、粉碎過不同目數篩，4℃條件下密封避光保存；食品級CO2（純度＞99.90%）：寧波方辛氣體有限公司。

試驗儀器：SFE－2型超臨界CO2萃取儀：美國Applied Separations公司；QP－2010氣相色譜質譜聯用儀：日本島津公司；高速粉碎機：上海江信科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 超臨界CO2萃取工藝流程

香榧假種皮→自然陰干→粉碎→過篩→超臨界CO2流體萃取→分離→香榧假種皮提取物

精確稱取10.00 g香榧假種皮于萃取釜中，設定萃取溫度，待溫度穩定后通入CO2氣體，并調節至一定壓力、溫度，待穩定后開始進行靜態萃取，靜態萃取一段時間后開啟出口閥，調節CO2流量進行動態萃取，收集萃取物。

1.2.2 香榧假種皮提取物得率的計算

利用減量法計算香榧假種皮提取物得率：

式中：W為香榧假種皮提取物得率／%；m1為萃取前萃取斧的質量；m2為萃取后萃取斧的質量；m為香榧假種皮的質量。

1.2.3 單因素試驗

原料粉碎度、萃取溫度、萃取壓力、萃取時間及CO2流速是影響超臨界 CO2萃取得率的主要因素［13－14］。綜合考慮設備條件和成本因素，選擇粉碎度、靜態萃取時間、動態萃取時間、萃取溫度、萃取壓力等5個主要因素，研究其對香榧假種皮提取物得率的影響。每組試驗重復3次，結果取平均值。

1.2.4 響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，固定粉碎度和靜態萃取時間，以動態萃取時間（X1）、萃取溫度（X2）、萃取壓力（X3）作為變量，以＋1、0、－1分別表示自變量的高、中、低水平，以香榧假種皮提取物得率（Y）為響應值，采用 Box－Behnken進行三因素三水平試驗設計，對香榧假種皮提取物提取工藝進行優化。響應面分析因素及水平如表1所示。每組試驗重復3次，結果取平均值。

表1 響應面分析因素及水平

1.2.5 氣相色譜質譜聯用分析條件

樣品前處理：取10 mg香榧假種皮提取物溶于1mL無水乙醇，滴加1滴1%酚酞乙醇溶液，然后滴加26%四甲基氫氧化銨甲醇溶液至紅色30 s內不褪色，進樣分析前過0.22μm微孔濾膜。

色譜條件：采用SPB－50石英毛細管氣相色譜柱（30.0 m×0.25mm×0.25μm），柱初溫40℃保持2min，然后以10℃／min速度升溫至130℃，再以5℃／min升溫至270℃，保持5min；進樣口溫度250℃；進樣量 1μL；分流比 30∶1；載氣為氦氣（99.99%）。

質譜條件：電離方式EI，電子能量70 eV，離子源溫度200℃，傳輸線溫度250℃，溶劑切除時間3min，掃描范圍45～650 u。定性分析經 NIST27和WILEY7質譜圖譜檢索確定香榧假種皮提取物各組分，采用峰面積歸一化法求各成分相對含量。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 靜態萃取時間對萃取得率的影響

在粉碎度20目、動態萃取時間2 h、萃取溫度40℃、萃取壓力30 MPa條件下，不同靜態萃取時間對香榧假種皮提取物得率的影響如圖1所示。

圖1 靜態萃取時間對萃取得率的影響

由圖1可以看出，隨著靜態萃取時間的增加，香榧假種皮提取物得率逐漸增加，但是靜態萃取時間超過20min以后，萃取得率增長趨勢逐漸變緩，因此選擇20min作為適宜的靜態萃取時間。

2.1.2 動態萃取時間對萃取得率的影響

在粉碎度20目、靜態萃取時間20min、萃取溫度40℃、萃取壓力30 MPa條件下，不同動態萃取時間對香榧假種皮提取物得率的影響如圖2所示。由圖2可知，香榧假種皮提取物得率隨著萃取時間的延長萃取得率逐漸升高。當時間大于2.5 h時，萃取得率增長緩慢，因此綜合考慮能耗和萃取效率，適宜的萃取時間為2.5 h。

圖2 動態萃取時間對萃取得率的影響

2.1.3 萃取溫度對萃取得率的影響

在粉碎度20目、靜態萃取時間20min、動態萃取時間2 h、萃取壓力30 MPa條件下，不同萃取溫度對香榧假種皮提取物得率的影響如圖3所示。

溫度對萃取得率的影響主要有兩方面：在一定的壓力下，溫度的升高引起溶質蒸汽壓的增長和流體密度的下降。當流體密度下降時，溶質在溶劑中的溶解度下降；當溶質的蒸汽壓上升時，組分在溶劑中的溶解性又增強，萃取得率的高低取決于何種狀態占優勢［15］。由圖3可知，萃取得率隨著溫度的升高逐漸提高，但是溫度超高45℃以后，萃取率增加緩慢，因此適宜的萃取溫度為45℃。

2.1.4 萃取壓力對萃取得率的影響

在粉碎度20目、靜態萃取時間20min、動態萃取時間2 h、萃取溫度40℃條件下，不同萃取壓力對香榧假種皮提取物得率的影響如圖4所示。

壓力對超臨界流體萃取的影響主要表現為：在一定范圍內壓力升高使CO2流體密度增加，溶解度增加，從而使萃取得率隨壓力升高而增加；但是壓力過高時，物料被壓實而增大了傳質距離和傳質阻力，萃取率降低［15］。由圖4可知，隨著萃取壓力的增加，萃取得率逐漸升高，但是萃取壓力超過35 MPa以后，萃取得率隨壓力的升高而降低。因此，選擇萃取壓力為35 MPa有利于萃取的進行。

圖4 萃取壓力對萃取得率的影響

2.1.5 粉碎度對萃取得率的影響

在靜態萃取時間20min、動態萃取時間2 h、萃取溫度40℃、萃取壓力30 MPa條件下，不同粉碎度對香榧假種皮提取物得率的影響如圖5所示。

圖5 粉碎度對萃取得率的影響

由圖5可以看出，粉碎度為20目的原料萃取得率明顯高于未粉碎和粉碎度為10目的原料，而粉碎度大于40目以后，萃取得率降低。原因是粉碎度的增加有助于CO2流體向物料內部滲透，減小了傳質距離和阻力，有利于萃取的進行；但是粉碎度過大，物料太細，高壓條件下原料易被壓實，從而增大傳質阻力，不利于萃取的進行，因此適宜的香榧假種皮粉碎度為40目。

2.2 響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，在粉碎度40目、靜態萃取時間20min的條件下，選取動態萃取時間（X1）、萃取溫度（X2）、萃取壓力（X3）作為變量，以香榧假種皮提取物得率（Y）為指標，采用 Box－Behnken進行三因素三水平試驗設計，響應面試驗設計方案及結果如表2～表3所示。

表2 響應面試驗設計方案及結果

利用Design－expert7.0軟件對表2數據進行分析，得到香榧假種皮提取物得率與各變量之間的二次方程模型：Y＝－193.17＋11.74X1＋5.33X2＋4.62X3－0.13X1X2＋0.06X1X3－0.02X2X3－1.62X12－該模型顯著性檢驗及方差分析見表3。

表3 回歸方程方差分析

由表3可以看出，模型P＜0.000 1，說明該二次方程模型達到極顯著水平；回歸系數R2＝0.988 5，說明該模型響應值的變化98.85%來自所選自變量；失擬項P＝0.341 1＞0.05，說明該方程與試驗數據擬合較好，將該模型用于香榧假種皮提取物的提取工藝優化是合適的。模型中一次項X1、X2、X3均達到顯著水平，二次項對模型影響極顯著，交互項X1X2、X2X3交互作用極顯著，X1X3之間交互作用不顯著，表明各因素對香榧假種皮提取物得率的影響并不是簡單的線性關系。模型中對香榧假種皮提取物得率影響的大小順序依次為X1＞X2＞X3，即動態萃取時間＞萃取溫度＞萃取壓力。

據模型多元回歸方程所作的響應面曲線及等高線圖見圖6～圖8，可以直觀地反映各因素之間的交互作用。3個曲面均為開口向下的凸形曲面，自變量X1、X2、X3與香榧假種皮提取物得率呈拋物線關系，且存在考察范圍內的極大值。

由圖6可以看出，在萃取壓力35 MPa條件下，動態萃取時間和萃取溫度交互作用極顯著（P＜0.01）。低溫區，萃取得率隨時間的增加呈逐漸上升的趨勢，而高溫區，萃取得率隨時間的增加呈現上升后下降的趨勢；低時間區，萃取得率隨溫度的增加呈逐漸上升的趨勢，高時間區，得率隨溫度的增加呈緩慢上升趨勢，當溫度達到一定值時，萃取得率變化平緩，后有下降的趨勢。說明溫度過高或者過低都不利于萃取的進行。

圖6 動態萃取時間和萃取溫度對提取物得率交互影響的三維曲面圖（a）和等高線圖（b）

由圖7可以看出，在萃取溫度45℃條件下，動態萃取時間和萃取壓力等高線圖呈圓形，說明二者之間交互作用不顯著（P＞0.05）。在低壓區，萃取得率隨時間的增加呈上升趨勢，當動態萃取時間達到一定值時，萃取得率變化緩慢；高壓區，萃取得率隨動態萃取時間的增加呈先上升后下降的趨勢。說明萃取初始階段，動態萃取時間與萃取得率呈正比例關系，當達到一定時間以后，萃取時間對提高得率影響不明顯。

圖7 動態萃取時間和萃取壓力對提取物得率交互影響的三維曲面圖（a）和等高線圖（b）

由圖8可以看出，在動態萃取時間2.5 h條件下，萃取溫度和萃取壓力之間交互作用顯著（P＜0.01）。在低溫區和高溫區，萃取得率都隨壓力的增加呈先上升后下降的趨勢，說明壓力過低或者過高都不利于萃取的進行。

圖8 萃取溫度和萃取壓力對提取物得率交互影響的三維曲面圖（a）和等高線圖（b）

2.3 最優條件的確定與驗證

對所得模型回歸方程3個自變量取一階偏導數等于零，可得 X1＝2.52 h、X2＝45.51℃、X3＝34.49 MPa，因此根據響應面分析結果預測香榧假種皮提取物工藝最優條件為：萃取時間2.52 h、萃取溫度45.51℃、萃取壓力34.49 MPa，在此條件下預測提取物得率為22.52%。

為檢驗結果的可靠性，在最優條件下進行驗證試驗?？紤]到實際操作的便利，將工藝參數修正為：萃取時間2.5 h、萃取溫度45℃、萃取壓力34 MPa，在此條件下進行3次試驗，所得平均提取率為（22.12±0.09）%，與理論預測值相對誤差為0.04%，說明該模型穩定可靠，具有一定的參考價值。

2.4 香榧假種皮超臨界CO2提取物主要成分分析

使用氣相色譜質譜聯用儀對所得香榧假種皮提取物主要成分及相對含量進行了測定，結果如表4所示。共鑒定了香榧假種皮超臨界CO2提取物中的51種成分，約占提取物相對總含量的90.77%。其主要成分為二萜類物質（69.61%），羧酸、酯類成分（12.14%），單萜和倍半萜類（8.96%）。相對含量在較高的成分有：山達海松酸（21.65%）、16，18－貝殼杉烯酸 （13.21%）、海松酸 （5.70%）、新樅酸（4.55%）、7，13，15－樅三烯酸（4.43%）、濕地松酸（4.42%）、脫氫樅酸（3.07%）、樅酸（2.62%）、大根香葉烯 D（1.10%）等。王貝貝等［16］對超臨界CO2萃取法香榧假種皮提取物成分進行分析，結果表明香榧假種皮超臨界CO2提取物成分主要以二萜類物質為主，與本研究結果一致；但是在化合物種類和含量方面有差異，與之相比，本研究優化提取工藝后得到的香榧假種皮提取物成分種類較多，得到了較多的單萜、倍半萜類化合物，如大根香葉烯D、β－金合歡烯等，能夠更全面地反映香榧假種皮提取物成分。

表4 香榧假種皮超臨界CO2提取物成分分析結果

表4 （續）

3 結論

3.1 在單因素試驗的基礎上，選取萃取時間、萃取溫度、萃取壓力作為Box－Behnken試驗設計變量，以香榧假種皮提取物得率為響應值，對香榧假種皮提取物的提取工藝進行優化。結果表明：動態萃取時間、萃取溫度、對萃取得率影響極顯著（P＜0.01），萃取壓力對萃取得率影響顯著（P＜0.05），動態萃取時間和萃取溫度、萃取溫度和萃取壓力之間交互作用極顯著（P＜0.01），動態萃取時間和萃取壓力之間交互作用不顯著（P＞0.05）；香榧假種皮提取物的最優提取工藝為：粉碎度40目，靜態萃取時間20min，動態萃取時間2.5 h、萃取溫度45℃、萃取壓力34 MPa，在此條件下進行3次試驗，所得平均提取率為（22.12±0.09）%，與理論預測值相對誤差為0.04%。

3.2 通過GC－MS測定出香榧假種皮超臨界CO2提取物中51種成分，約占提取物相對總含量的90.77%。其主要成分為二萜類物質（69.61%），羧酸、酯類成分（12.14%），單萜和倍半萜類（8.96%）。其中，二萜類物質如新樅酸、山達海松酸、樅酸、濕地松酸、海松酸已被廣泛應用于肥皂、造紙、油墨、橡膠等行業。單萜和倍半萜類物質中大根香葉烯D、檸檬烯、Δ－杜松烯等是揮發油的主要成分，可作為香料被廣泛應用于食品和化妝品行業。

總之，優化后的超臨界CO2流體萃取香榧假種皮提取物工藝對香榧假種皮中的活性物質具有較好的提取、分離效果，該提取工藝將為香榧生產中大宗廢棄物假種皮的開發利用提供有利的技術方法。

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Process Optimization and Principal Component Analysis of Extracts from Chinese Torreya by Supercritical CO2Technology

Yu Yongjie1Han Qin1Ni Sui1Wu Yufen2Sang Weiguo1

（School of Marine Sciences，Ningbo University1，Ningbo 315211）
（Ninghai Forestry Technology Extension Station2，Ninghai 315600）

A response surfacemethod（RSM）was used to optimize supercritical CO2extraction（SCE）of the extracts from Chinese Torreya aril and themain components of aril extractswas analyzed by gas chromatograph－mass spectrometer（GC－MS）.Based on the single factor experiments，the dynamic extraction time，extraction temperature and extraction pressure were selected as variables.The extraction yield of Chinese Torreya aril was regarded as index and the three－factor and three－level experimentwas conducted by Box－Behnke experiment design method.The optimization process of extracts of Chinese Torreya aril by supercritical CO2extraction was particle size of 40 mush，extraction time of 20min，dynamic time of 2.5 h，temperature of 45℃ and pressure of 34 MPa.The optimal yield（22.12±0.09%）was obtained at the operating conditions.The results of GC－MS analysis showed that the main complements of aril extractswere diterpenoids，fatty acid，followed by sesquiterpenoids and monoterpenoids.

supercritical CO2extraction，Chinese torreya aril，response surfacemethod，gas chromatographmass spectrometer

TS229

A

1003－0174（2015）06－0067－07

寧波市重大（重點）科技攻關計劃（2012C10015）

2014－01－13

于勇杰，男，1990年出生，碩士，食品工程

倪穗，女，1965年出生，教授，植物生物技術