明綠豆苯丙氨酸解氨酶的分離純化及性質初步研究

張 瑜 李梅青，2 代蕾莉 蔡 娟 付志偉

（安徽農業大學茶與食品科技學院1，合肥 230036）

（合肥農產品加工研究院2，合肥 230036）

明綠豆苯丙氨酸解氨酶的分離純化及性質初步研究

張 瑜1李梅青1，2代蕾莉1蔡 娟1付志偉1

（安徽農業大學茶與食品科技學院1，合肥 230036）

（合肥農產品加工研究院2，合肥 230036）

為了研究明綠豆中苯丙氨酸解氨酶（PAL）的動力學特性，采用35%和65%飽和度的硫酸銨分級沉淀、DE－52陰離子交換層析方法對明綠豆中的PAL進行了分離純化，并對其基本性質做了初步研究。結果表明，PAL的純化倍數為6.982 9，蛋白質得率為4.65%，酶得率為32.45%。PAL在硼砂－硼酸緩沖溶液中適宜的pH范圍為7.6～9.0，最適pH有2個：8.0和8.6。PAL適宜的溫度范圍為35～45℃，最適反應溫度為40℃。得到 PAL的 2個 Km值，分別是：Km1為6.94×10－5mol／L，Km2為 1.23×10－4mol／L。本研究結果可為進一步研究和開發明綠豆的PAL提供參考。

明綠豆 苯丙氨酸解氨酶 分離純化 基本性質

綠豆（Mung bean）為豆科草本植物綠豆（Phaseolus radiatus）的成熟種子［1］?！侗静菥V目》中提及：“綠豆，消腫治痘之功雖同于赤豆，而壓熱解毒之力過之”，并可“解金石、砒霜、草木一切諸毒”?？梢姽湃苏J識到綠豆具有清熱解暑、止渴利尿、消腫止癢、解毒等藥用功效［2－3］。

苯丙氨酸解氨酶（L－phenylalanine ammonialyase，PAL；EC4.3.1.5）能催化L－苯丙氨酸生成反式肉桂酸進入苯丙烷代謝途徑，為多種酚類、生物堿及類黃酮等終產物提供前體物質，是連接初級代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷類代謝第一步反應的關鍵酶和限制酶［4－5］。Abell等［6］依據 PAL特異的催化反應將其用于抗腫瘤和治療苯丙酮尿癥的研究中，并取得了肯定的結果。PAL主要存在于高等植物（如：銀杏葉［7］、山藥［8］、石斛［9］、綠豆［10］等）、部分微生物（絲狀真菌、酵母及鏈霉菌）和某些藻類中。國內有研究證明，從綠豆中提取的PAL對小鼠淋巴白細胞白血病細胞株（L1210）的抑制作用隨作用時間的延長和藥物劑量的增加而增強［10］。然而，綠豆中PAL純化及基本性質的研究鮮見報道。

明光綠豆以其色澤晶瑩碧綠，粒大皮薄、湯清易爛，清香可口等特點，質量為全國之冠，被稱為“明綠”，曾經被作為貢品。2008年，“明光綠豆”獲得國家原產地保護標志，然而，對其功能性成分分析研究極少。

本研究采用鹽析方法分離明綠豆中的PAL，采用離子層析法對其進一步純化，并對其性質進行初步研究，系統了解明綠豆PAL的反應動力學特性，為明綠豆功能性成分的高效利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

明綠豆：安徽燕之坊食品有限公司；β－巰基乙醇、EDTA、L－苯丙氨酸、牛血清蛋白均為分析純。高速冷凍離心機（LR16－A）：北京雷勃爾離心機有限公司；DE－52：Whatman分裝。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶活性及蛋白質的測定

1.2.1.1 酶活性測定及活性單位的定義

采用Koukol等［11］的方法，略加修改。吸取0.5mL 0.06mol／L的L－苯丙氨酸和9.45mL硼酸－硼砂緩沖溶液（pH 8.7，20 mmol／Lβ－巰基乙醇，1 mmol／L的EDTA），加入0.05mL的酶液。同時調零管取0.5mL 0.06mol／L的L－苯丙氨酸，加9.5mL的硼酸－硼砂緩沖溶液；對照管加入9.95mL的硼酸－硼砂緩沖溶液和0.05mL的酶液。40℃水浴反應1 h，滴加6mol／L的 HCl 0.2mL終止反應，于290 nm處比色。以每小時每毫升酶液光密度值增加0.01為一個酶活單位（U）。所有測定均重復3次。

1.2.1.2 蛋白質含量的測定

參照Bradford等［12］方法以牛血清蛋白做標準曲線得到回歸方程：y＝0．492 8x＋0．026 5。

1.2.2 明綠豆PAL粗酶液的制備及分離純化

1.2.2.1 PAL粗酶液的提取

取明綠豆80 g，加入預冷的硼酸－硼砂緩沖溶液160mL，于4℃的冰箱浸泡24 h。搗碎，勻漿，4℃下12 000 r／min離心20min，上清液即為粗酶液，取粗酶液4℃下保存以供純化。

1.2.2.2 硫酸銨分級沉淀及脫鹽濃縮

將固體硫酸銨粉末加入粗酶液至35%飽和度，磁力攪拌30min，4℃靜置4 h。4℃下12 000 r／min離心20min，取上清液加固體硫酸銨粉末到65%飽和度，然后依據上述方法，4℃下12 000 r／min離心20min，棄上清液。將沉淀復溶于70mL 0.05mol／L的Tris－HCl（pH＝8.8）緩沖溶液中。將復溶后的酶液裝入已經處理好的透析袋中，4℃下用0.05mol／L的Tris－HCl緩沖溶液中脫鹽10 h，然后再用聚乙二醇濃縮1 h。

1.2.2.3 PAL粗酶液的純化

將濃縮后的酶液過DE－52層析柱（Φ2.6 cm×30 cm，已用 pH為8.8的0.05mol／L Tris－HCl緩沖溶液平衡），以0～0.8mol／L的 NaCl Tris－HCl（pH 8.8）緩沖溶液梯度洗脫，每5min 1管，每管10mL。合并有酶活的部分，然后經透析、超濾濃縮、冷凍干燥得純酶。

1.2.3 PAL酶學性質

1.2.3.1 明綠豆PAL最適pH、溫度、酶濃度、底物濃度的測定

根據酶活性測定的反應體系，以0.06mol／L的L－苯丙氨酸為底物，在pH值為7.6～9.2的硼酸－硼砂緩沖溶液反應體系中設定一系列pH梯度，測定各梯度pH的酶活力，確定PAL的最適pH；在25～80℃溫度范圍內，設置一系列的溫度梯度，測定各溫度梯度下PAL的酶活力，確定最適反應溫度；分別取PAL酶液0.1～1.7mL，設置一定酶濃度梯度的反應體系，并測定各酶濃度梯度下PAL的酶活，確定最適酶濃度。在L－苯丙氨酸的終物質的量濃度為0.5～9 mmol／L內，設置一系列底物濃度的反應體系，并測定各體系中PAL的活力，確定最適底物濃度。

1.2.3.2 明綠豆PAL動力學曲線

取0.05mL的酶液和0.5mL的0.06mol／L的L－苯丙氨酸溶液，加pH 8.7硼酸－硼砂緩沖溶液定容至10mL，于40℃水浴。5～360min內設置一系列的時間梯度，并測定各時間梯度PAL的酶活力。

1.2.3.3 明綠豆PAL的Km值

在9.45mL pH 8.7硼酸－硼砂緩沖溶液中加入0.05mL酶液，再分別加入0.5mL物質的量濃度0.001～0.01mol／L的L－苯丙氨酸溶液，測定各濃度對應的PAL酶活力。將各底物濃度的酶活力對反應時間作圖，求出酶促反應速度V。分別求出1／［V］及1／［S］，按照 Lineweaver－Burk雙倒數法作圖，求出PAL的Km值。

2 結果與分析

2.1 明綠豆PAL的分離純化

明綠豆PAL粗酶液經硫酸銨分級沉淀、脫鹽濃縮以及DE－52層析，分離純化結果見表1，洗脫結果見圖1。

表1 明綠豆PAL的分離純化結果

圖1 明綠豆PAL纖維素DE－52層析結果

由表1可知，明綠豆PAL的純化倍數為6.982 9，蛋白質得率為4.65%，酶得率為32.45%。由圖1可知有2個活力峰，從而推測PAL有2種同工酶。

2.2 明綠豆PAL最適pH、溫度、酶濃度、底物濃度

由圖2可以看出，在不同pH的硼酸－硼砂緩沖溶液中酶活力出現2個峰值，即2個最適pH值：8.0和8.6，這可能與明綠豆體內含有PAL的同工酶有關［13］。明綠豆PAL在 pH 7.6～9.0時酶活力都在其最大活力的50%以上，因此該酶在pH 7.6～9.0之間比較穩定。PAL維持活性的最適pH范圍為8.0～9.5。

圖2 酶的最適pH

由圖3可知，明綠豆PAL在25～40℃時，酶活性隨著溫度的升高而上升。當溫度處于35～40℃范圍時，酶活力較高，為最適溫度范圍，40℃時明綠豆PAL活力最高，45℃以后酶活性受到抑制。當溫度接近80℃時PAL的活力已基本喪失。此結果與其他材料中的PAL研究結果基本一致［14－18］。

圖3 酶的最適溫度

如圖4所示，明綠豆PAL的最適底物物質的量濃度為1.5 mmol／L，此時酶活力達到最大值，而當底物物質的量濃度達到5 mmol／L時，酶活性到達第二個峰值。然后隨底物濃度的增大，酶活力減少。當底物物質的量濃度增大到7 mmol／L時，酶活力逐漸保持穩定。

圖4 底物濃度對酶活力的影響

由圖5可知，在酶量較低，即酶量小于0.13mL時，隨著酶量的增加，其吸光值增加較明顯。當加酶量高于0.13mL時，吸光值的增加緩慢。這可能是因為此時底物相對于酶是過量的，而高濃度的底物會抑制底物，增加酶的濃度能解除這種抑制，從而增加酶的含量，提高酶的反應速率。當酶濃度較高而底物濃度不足時將產生限制因子，反應速度與酶濃度之間不再保持線性關系，或者是酶作用產物的增加對酶產生抑制作用，從而導致反應速度增長量的下降［9］。

圖5 酶量對酶活力的影響

2.3 明綠豆PAL的動力學曲線

PAL催化L－苯丙氨酸反應生成反式肉桂酸，在反應開始的3 h內，反應產物與反應時間基本成線性關系（圖6），但是反應在80min內的速率比80～180min內的反應速率高。PAL在反應3 h之后，反應進程曲線逐漸變平。這是因為苯丙氨酸逐漸減少，反式肉桂酸的生成量逐漸積累，對酶的反饋抑制作用加強，所以反應速度逐漸下降［8］。

圖6 PAL的反應進程曲線

2.4 明綠豆PAL的Km

用Lineweaver－Burk雙倒數法作圖，結果如圖7所示。Km即為直線在X負軸上截距的負倒數。由圖7可知明綠豆PAL有2個Km值，通過計算可得：Km1為 6.94×10－5mol／L，Km2為 1.23×10－4mol／L，這與0.3×10－4～1.5×10－2mol／L之間的結果相一致［5］。

圖7 PAL雙倒數作圖

3 討論

試驗結果的蛋白質得率偏低，這或許與本試驗在進行粗酶分離時所采用的硫酸銨的飽和度、離子強度以及緩沖溶液的pH沒有經過優化有關。離子洗脫時PAL得率偏低，主要是因為PAL存在同工酶［13］，經硫酸銨分級沉淀及DE－52柱后去除了部分同工酶，純化出單一酶的過程可能造成部分損失所致。

對PAL性質的前期研究發現：銀杏葉中PAL的2個最適pH 8.0和8.8［19］、山藥中PAL的2個最適pH 8.0和 8.8［8］、霍山石斛中 PAL的最適 pH 8.4［9］，無殼葫蘆籽中的最適pH 8.5［14］，這表明不同植物來源的PAL的最適pH存在差異。

本研究中底物濃度對PAL活力的影響曲線圖呈S型，這與其他原材料 PAL研究結果類似，如銀杏［19］、石斛［9］、山藥［8］及蘆筍［20］等，這可能與不同來源PAL普遍存在同工酶有關。同時有報道稱，如果PAL存在別構酶，也會導致這種情況的出現［21］。對此，還需進一步研究。

4 結論

明綠豆PAL的純化倍數為6.982 9，蛋白質得率為4.65%，酶得率為32.45%。PAL適宜的pH范圍為7.6～9.0，最適pH值分別為8.0和8.6。適宜的溫度范圍為35～45℃，最適反應溫度為40℃，45℃以后酶活性受到抑制。當溫度接近80℃時PAL的活力已基本喪失。

明綠豆PAL的最適底物物質的量濃度為1.5 mmol／L。當底物物質的量濃度增大到7 mmol／L時，酶活力逐漸保持穩定。

明綠豆PAL催化L－苯丙氨酸反應生成反式肉桂酸，在反應的開始3 h內，反應產物與反應時間基本成線性關系。反應3 h之后，反應進程曲線逐漸變平。所以在測定PAL的活性時，反應時間選擇3 h之內為基準，以1 h的反應產物量表示酶的活力。

Lineweaver－Burk雙倒數法作圖，得到明綠豆PAL的2個 Km值，分別是：Km1為6.94×10－5mol／L，Km2為 1.23×10－4mol／L。

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Purification and Properties of Phenylalanine Ammonia－Lyase in Ming Mung Bean

Zhang Yu1Li Meiqing1，2Dai Leili1Cai Juan1Fu Zhiwei1

（Anhui Agricultural University School of Tea and Food Science＆Technology1，Hefei 230036）
（Institute of Hefei Agricultural Products Processing2，Hefei 230036）

The study in this paper aimed to research the dynamics characteristics of phenylalanine ammonialyase（PAL）from Mingmung bean.The isolation，purification and basic properties of L－phenylalanine ammonialyase in Mingmung bean were studied by 35%and 65%saturation of ammonium sulfate grade deposition，DE－52 anion exchange chromatography.The results showed that the purification multiple was 6.982 9 and protein yield and PAL yield were 4.65%and 32.45%respectively.The optimal pH range of PAL in borax－boric acid buffer was 7.6～9.0 and there were two optimal pH as 8.0 and 8.6.The optimal temperature range of PAL was 35～45℃.The optimal temperaturewas40℃.Therewere two Kmvalues including 6.94×10－5mol／L and 1.23×10－4mol／L.The results provided the reference for further studying and developing PAL of Mingmung bean.

mingmung bean，L－phenylalanine ammonia－lyase，isolation and purification，basic properties

Q946.5

A

1003－0174（2015）06－0101－05

合肥農產品加工研究院資助院企合作項目（2012HAP P002）

2014－01－22

張瑜，女，1988年出生，碩士，植物源食品開發與利用

李梅青，女，1965年出生，副教授，農產品加工與貯藏