免疫FISH技術檢測腦脊液中循環腫瘤細胞在肺癌腦膜轉移診斷中的應用*

馬春華 姜镕 呂遠 穆寧 李金鐸 王斌 孫立偉

·臨床研究與應用·

免疫FISH技術檢測腦脊液中循環腫瘤細胞在肺癌腦膜轉移診斷中的應用*

馬春華 姜镕 呂遠 穆寧 李金鐸 王斌 孫立偉

目的：探討免疫FISH技術檢測腦脊液中腫瘤細胞在肺癌腦膜轉移診斷中的應用價值。方法：應用免疫FISH技術平臺檢測16例肺癌腦膜轉移患者以及8例腦部非腫瘤疾病患者的腦脊液中循環腫瘤細胞。腦膜轉移患者根據神經系統癥狀、增強MRI檢查和腦脊液細胞學檢查確診。結果：肺癌腦膜轉移患者的循環腫瘤細胞數目明顯高于腦部非腫瘤疾病組，差異具有統計學意義（P＜0.01）。根據受試者工作曲線（ROC曲線）確定滿足正確診斷指數（Youden指數）最大值的臨界點為腦脊液循環腫瘤細胞檢測陽性的判定標準，循環腫瘤細胞為1個/7.5 mL腦脊液時曲線下面積（AUC）為0.875，AUC 95%CI為0.705～1.000，診斷的敏感性為75%，特異性為100%，有效性為83.3%，陽性預測值為100.0%，陰性預測值為66.7%。結論：免疫FISH技術檢測腦脊液中循環腫瘤細胞對于肺癌腦膜轉移的診斷具有重要的臨床意義。

循環腫瘤細胞 肺癌 腦膜轉移 診斷 免疫熒光

腦膜轉移癌（meningeal metastasis，MM）是惡性腫瘤細胞在腦膜和脊髓蛛網膜下腔彌漫性播散或呈局灶浸潤的一種中樞神經系統轉移癌，常繼發于白血病、淋巴瘤、肺癌和乳腺癌［1］。MM進展快，預后極差，未經治療的腦膜轉移癌患者中位生存期僅4～6周［2］。因此，尋找一種靈敏的方法來檢測腦膜的潛在轉移是十分必要的。近年研究顯示血液循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）即脫落入血的實體腫瘤細胞，與腫瘤診斷［3］、轉移和預后［4-6］等有著極大的相關性。本研究應用免疫FISH技術檢測肺癌腦膜轉

移患者腦脊液中的循環腫瘤細胞，以期評價循環腫瘤細胞檢測在肺癌腦膜轉移輔助診斷中的應用價值，并選擇最理想的腦脊液中循環腫瘤細胞判斷標準，以期提高肺癌腦膜轉移的早期診斷率。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 入組標準 1）經組織學或細胞學明確診斷的非小細胞肺癌患者；2）確診的腦膜轉移癌患者；3）MRI檢查顱內無直徑超過l cm的轉移病灶；4）6個月內無腦炎及顱腦外傷病史，未經過腦部手術或者放療；5）經脫水藥物治療后顱內高壓癥狀可獲得控制；6）患者能夠耐受腰椎穿刺采集腦脊液；7）排除合并顱內腦膜瘤、室管膜瘤、脊膜瘤等腦脊髓膜病變患者。按此標準共入組16例患者，男性2例，女性14例，中位年齡62（46～76）歲，病理類型均為肺腺癌，5例患者合并腦實質轉移。腦膜轉移癌診斷標準：1）具有明確的腫瘤病史；2）出現新發神經系統癥狀與體征；3）典型的腦部MRI增強表現；4）腦脊液細胞學檢查發現腫瘤細胞。凡具備前2項及第3或4項中任一項即可確診［7］。

1.1.2 腦部非腫瘤病變患者入組標準 1）與試驗組患者同期住院的腦部非腫瘤病變患者，如腦積水、神經系統變異性疾病等；2）住院期間需進行腦室外引流術、腦室-腹腔分流術、腰大池引流術、腰椎穿刺行腦脊液檢查等診斷治療者。按此標準共入組8例患者，男性6例，女性2例，中位年齡40（35～60）歲，均為交通性腦積水住院治療。本研究經醫院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 免疫FISH技術檢測 所有腦膜轉移組患者均通過腰椎穿刺采集腦脊液7.5 mL存于免疫FISH檢測專用試管內，腦部非腫瘤病變組均經過腦室外引流管獲取7.5 mL腦脊液，均儲存于免疫FISH檢測專用試管內。常溫保存，72 h內應用免疫FISH技術進行腫瘤細胞檢測。檢測使用試劑：包被CD45抗體的免疫磁珠、4，6-聯脒-2-苯基吲哚（DAPI）、8號染色體著絲粒探針（CEP8）、上皮細胞標志物（PAN-CK）以及CD45抗體均購自美國Cytelligen公司。檢測步驟分為：1）免疫磁珠陰性篩選法富集細胞：使用抗包被CD45抗體的免疫磁珠去除CD45陽性的白細胞，將7.5 mL腦脊液制備成100 μL細胞懸液。2）細胞計數：固定100 μL細胞懸液滴片，分別采用DAPI染色（陽性表明捕獲到的細胞為有核細胞）、CEP8檢測細胞8號染色體數目、PAN-CK染色（陽性表明捕獲到的細胞為上皮來源）和CD45抗體染色（陰性表明捕獲到的細胞為非白細胞）進行免疫熒光分析。Olympus-BX53熒光顯微鏡（日本Olympus公司）下進行細胞計數，重復計數5次取平均值作為最終值。

1.2.2 循環腫瘤細胞判斷標準 熒光顯微鏡的藍色通道下觀察DAPI染色，藍色熒光者表明為有核細胞；橙色通道下觀察CEP8 FISH信號，橙色亮點數目即為8號染色體數目，大多數CTCs 8號染色體呈多倍體，即CEP8陽性，血源性白細胞8號染色體呈二倍體，即CEP8陰性；綠色通道下觀察細胞是否表達PAN-CK，呈綠色熒光即為陽性；紅色通道下觀察細胞是否表達CD45，呈紅色熒光即為陽性。最后在多通道下再次確認細胞為非血源性上皮細胞來源的腫瘤細胞，根據是否將8號染色體為二倍體的有核非血源性細胞判定為循環腫瘤細胞，即DAPI＋、CD45－、PAN-CK+或PAN-CK－、CEP8－。將判斷循環腫瘤細胞的標準分為標準1：DAPI＋、CD45－、PAN-CK+或PAN-CK－、CEP8＋或CEP8－；標準2：即DAPI＋、CD45－、PAN-CK＋或PAN-CK－、CEP8＋。呈現DAPI＋、CD45＋、PAN-CK－、CEP8－時，則表明細胞為白細胞（圖1）。

圖1 熒光顯微鏡下富集的細胞圖像（DAPI×400）Figure 1 Image of enriched cells under fluorescence microscope（DAPI× 400）

1.3 統計學方法

將各組數據經SPSS 17.0統計軟件處理。計量資料以x±s表示，應用秩和檢驗行統計學分析，并計算診斷敏感性、特異性、有效性、陽性預測值和陰性預測值，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同判斷標準判定發現CTCs結果

按照判斷循環腫瘤細胞的標準1，16例患者腦膜轉移組腦脊液標本中有12例腦脊液發現循環腫瘤細胞，8例腦部非腫瘤病變患者腦脊液標本中有2例發現循環腫瘤細胞。按照判斷循環腫瘤細胞的標準2，16例患者腦膜轉移組腦脊液標本有12例腦脊液發現循環腫瘤細胞，8例腦部非腫瘤病變患者腦脊液標本中未發現循環腫瘤細胞。按照標準1和標準2在腦膜轉移組腦脊液中判定發現的腫瘤細胞數均明顯高于腦部非腫瘤病變組，差異具有統計學意義（均P＜0.05）。腦膜轉移組和腦部非腫瘤病變組按照標準1發現的循環腫瘤細胞數均多于按照標準2發現的腫瘤細胞數，但差異無統計學意義（均P＞0.05，表1）。

2.2 不同判斷標準CTCs診斷臨界值的確定

腦脊液腫瘤細胞檢測診斷肺癌腦膜轉移尚無統一評價標準以及診斷臨界值，本研究根據受試者工作曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）確定兩種判斷標準的曲線下面積（area under curve，AUC）以及腦脊液腫瘤細胞檢測指標的臨界點。標準1的曲線下面積小于標準2的曲線下面積（表2，圖2）。

表1 不同判斷標準的CTCs檢測結果（個/7.5 mL，x±s）Table 1 Detection results of CTCs based on different judging criteria（n/ 7.5 mL，x±s）

表2 不同判斷標準下確定CTCs診斷臨界值的相關指標Table 2 Relevant indexes of the CTCs diagnosis critical value based on different judging criteria

圖2 免疫FISH檢測CTCs診斷腦膜轉移的ROC曲線Figure 2 Receiver operating characteristic（ROC）curves of CTCs in diag?nosis of meningeal metastasis by immunoFISH technology

在ROC曲線中，滿足正確診斷指數（Youden's index）最大值的臨界點為本研究陽性判定值。按照標準1判定CTCs診斷腦膜轉移時，Youden指數最大值為0.688，CTCs診斷臨界值為3個/7.5 mL腦脊液，診斷敏感度為68.8%，特異性為100%。按照標準2判定CTCs診斷腦膜轉移時，Youden指數最大值為0.750，CTCs診斷臨界值1個/7.5 mL腦脊液，診斷敏感度為75.0%，特異性為100%（表3）。

2.3 腦脊液循環腫瘤細胞對肺癌腦膜轉移診斷的相關指標

按照標準2判定腦脊液腫瘤細胞對肺癌腦膜轉移的診斷具有較高的特異性、有效性、陽性預測值及陰性預測值（表4）。

表3 兩種標準判定的CTCs變量對應的ROC曲線下坐標點Table 3 Coordinate points of ROC curves corresponding to CTCs based on two judging criteria

表4 腦脊液腫瘤細胞對肺癌腦膜轉移診斷的相關指標Table 4 Relevant indices of CTCs in CSF for diagnosis of meningeal me?tastasis from lung cancer

3 討論

肺癌腦膜轉移患者病情進展快，預后極差。早期診斷及治療可有效延緩因病情進展而導致的神經功能缺損。目前診斷腦膜轉移主要采用以下標準［7］：1）具有明確的腫瘤病史；2）出現新發神經系統癥狀與體征；3）典型的增強MRI表現；4）腦脊液細胞學檢查發現腫瘤細胞。凡具備前兩項及第3或4項中任一項即可確診。然而，超過90%腦膜轉移瘤患者無典型的中樞神經系統的癥狀和體征［8-9］，腦膜轉移癌的臨床表現常因腫瘤細胞侵犯的部位不同而復雜多樣，缺乏特異性，與腦實質、脊髓轉移引起的癥狀以及治療原發腫瘤出現的不良反應較難鑒別。腦脊液細胞學首次檢查的陽性率僅為55%，再次檢查的陽性率達80%，3次以上的腦脊液細胞學檢查并不增加檢測陽性率［10］。頭部強化MRI的特異性幾乎能夠達到100%，但存在65%假陰性率和10%假陽性率［11］。因此，本研究認為上述診斷方法在腦膜轉移癌診斷和療效評價方面不能滿足臨床醫師的需要，尋找敏感度和特異性更高的檢測方式是十分必要的。免疫FISH檢測是通過富集技術和分析技術在生物體液標本中有效鑒別各種非血源性腫瘤上皮細胞，研究報道其檢測肺癌腦膜轉移患者腦脊液中的循環腫瘤細胞具有較高的敏感度［12-13］。應用免疫FISH檢測腦膜轉移組及腦部非腫瘤病變組患者腦脊液中的循環腫瘤細胞，探討其在肺癌腦膜轉移輔助診斷中的價值。

臨床上“理想”的檢測方式應具有100%特異性和100%敏感度，且具有可靠的預測價值。由于腫瘤的發生、發展和轉歸過程十分復雜，臨床上很難有“理想”的檢測方式。臨床上選擇靈敏度較高的指標勢必增加假陽性率，選擇特異性較高的指標又增加假陰性率。陽性預測值（positive predictive value，PPV）是指篩檢試驗檢出的全部陽性例數中，真正患病的例數（真陽性）所占的比例，反映篩檢試驗結果陽性者患目標疾病的可能性。陰性預測值（negative pre?dictive value，NPV）是指篩檢試驗檢驗結果為陰性的受試者中真正未患病的比例。診斷試驗的預測值受到敏感度、特異度和受試者中患病率的影響。以ROC曲線確定診斷試驗臨界值，可使假陽性和假陰性的結果控制在較小的范圍。本研究選用Youden指數最大值的臨界點為腦脊液循環腫瘤細胞陽性判定標準，最大程度兼顧敏感性和特異性［14］。ROC曲線下面積（AUC）作為診斷試驗真實性評價的固有準確度指標已被普遍認可，完全無價值的診斷試驗AUC為0.5，理想的診斷試驗AUC為1，而一般認為對于一個診斷試驗，AUC為0.5～0.7時診斷價值較低，0.7～0.9時診斷價值中等，0.9以上時診斷價值較高［15］。

本研究中，標準1和標準2的區別在于是否將8號染色體陰性的非血源性細胞判定為循環腫瘤細胞，按照標準1判定腦脊液中循環腫瘤細胞時發現的細胞數多于按照標準1發現的細胞數，但差異無統計學意義（P＞0.05）。在ROC曲線中，按照標準2判定腦脊液腫瘤細胞診斷腦膜轉移的各項指標均優于按照標準1所得結果。兩種檢測標準判斷的CTCs診斷腦膜轉移的敏感度均為75%，但按照標準2判定腦脊液腫瘤細胞對肺癌腦膜轉移的診斷特異性、有效性、陽性預測值及陰性預測值更高。因此，推薦采用標準2（DAPI＋、CD45－、PAN-CK+或PAN-CK－、CEP8＋）來判定腦脊液中的循環腫瘤細胞。本研究發現，8號染色體陰性的非血源性細胞可能是脫落的腦膜細胞或者腰椎穿刺術、腦室外引流術等臨床操作造成的表皮細胞脫落進入腦脊液標本，進而增加了診斷的假陽性率，但由于本研究樣本量小，對于去除該類細胞是否會增加假陰性率需要進一步探討。

在ROC曲線中，按照標準2判定CTCs診斷肺癌腦膜轉移，即腦膜轉移患者7.5 mL腦脊液中發現1個CTCs診斷腦膜轉移的敏感度為75.0%、特異性為100.0%、有效性為83.3%、陽性預測值為100.0%、陰性預測值為66.7%。因此，應用免疫FISH檢測腦脊液中的腫瘤細胞診斷肺癌腦膜轉移具有較好的臨床價值。但由于本研究樣本量小，對于同一樣本多次檢測是否會增加診斷敏感性，以及腦脊液循環腫瘤細胞檢測對療效評價、患者預后有無意義，需加以更多的臨床研究。

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（2015-05-14收稿）

（2015-06-08修回）

（編輯：楊紅欣）

馬春華 專業方向為中晚期肺癌的治療及基礎研究。

E-mail：mch8178@163.com

放療應為頭頸部惡性腫瘤治療首選

2015年5月，國際腫瘤放射治療新進展論壇在天津召開。中國抗癌協會腫瘤放射治療專業委員會候任主任委員、天津醫科大學腫瘤醫院院長王平教授報告提出，由于頭頸部腫瘤部位特殊且多數腫瘤對放療敏感，放療應成為治療的首選方案，而非繼外科手術后的“備選”。

頭頸部腫瘤包括發生于眼球、耳鼻喉、副鼻竇、顏面部等的惡性腫瘤。由于頭頸部集中了視神經、垂體、腦干、脊髓等大量重要器官和組織，會限制擴大切除手術的應用，影響手術療效。而上述大部分腫瘤可通過放療有效治療，甚至治愈。王平教授指出，以鼻咽癌為例，放療已成為公認的唯一可以治愈鼻咽癌的手段，患者5年控制率可達80%以上，早期病例5年控制率更是高達90%。但個別醫院對此病認識不足，對早期鼻咽癌患者采用復雜手術治療或內鏡下手術治療，易造成短期時間內腫瘤復發及進展。

王平教授表示，對喉癌、口咽癌、下咽癌、舌根癌、舌癌、兒童視網膜母細胞瘤、顏面部皮膚癌等頭頸部惡性腫瘤，放療也能取得與手術相同的治療效果。以早期喉癌為例，手術治療以及放射治療均可實現5年生存率90%左右的治療效果。而放療能夠保留喉功能，使患者基本能夠正常發音且遠期副作用輕微。

天津醫科大學腫瘤醫院放療科副主任王佩國指出，放療也不可避免地存在一些不良反應。如何更加精準地對腫瘤進行靶向打擊，降低不良反應，如何與手術治療、化療等傳統手段聯合使用，如何與免疫治療等新型技術“捆綁應用”等，仍是放療學科需要解決的問題。

——引自“天津醫科大學腫瘤醫院”網站

ImmunoFISH technology for detection of circulating tumor cells in cerebrospinal fluid to diagnose meningeal metastasis from lung cancer

Chunhua MA,Rong JIANG,Yuan LV,Ning MU,Jinduo LI,Bin WANG,Liwei SUN
Department of Intervention,Tianjin HuanHu Hospital,Tianjin Key Laboratory of Cerebral Vascular and Neurodegenerative Diseases,Tianjin 300060,China.
This work was supported by grants from the Science and Technology Foundation of Tianjin Municipal Health Bureau (2014kz042).

Jiang Rong,E-mail:jiangrong1989@sina.com

Objective:To investigate the effectiveness of immunoFISH technology in detecting tumor cells in cerebrospinal fluid (CSF)for adjuvant diagnosis of meningeal metastasis from lung cancer.Methods:Circulating tumor cells(CTCs)were detected by immunoFISH technology in CSF samples from 16 patients with meningeal metastasis from lung cancer and 8 patients with non-tumorous brain diseases.Meningeal metastasis from lung cancer was diagnosed on the basis of neurological symptoms and confirmed by enhanced magnetic resonance imaging and CSF cytological examination.Results:The number of CTCs was significantly greater in patients with meningeal metastasis from lung cancer than in those with non-tumorous brain diseases(P＜0.01).The critical point of the maximum correct diagnosis index(Youden index)was regarded as the judging criterion for the positive tumor cells in CSF based on the receiver operating characteristic curve.When one tumor cell existed in 7.5 mL of CSF,the area under the curve was 0.875,and the 95% confidence interval ranged from 0.705 to 1.000.The diagnostic sensitivity,specificity,effectiveness,positive predictive values,and negative predictive values were 75.0%,100.0%,83.3%,100.0%,and 66.7%,respectively.Conclusion:ImmunoFISH technology provides great significance in detecting CTCs in CSF to diagnose meningeal metastasis from lung cancer.

circulating tumor cells,lung cancer,meningeal metastasis,diagnosis,immunoFISH

10.3969/j.issn.1000-8179.20150550

天津市環湖醫院腫瘤介入科，天津市腦血管與神經變性重點實驗室（天津市300060）

*本文課題受天津市衛生局科技基金項目（編號：2014KZ042）資助

姜镕 jiangrong1989@sina.com