PLXNC1多態性與廣西肝癌遺傳易感的關系及其表達*

何承誠 謝裕安 毛賽蘭 黃正 閆雷 趙瑞強

·臨床研究與應用·

PLXNC1多態性與廣西肝癌遺傳易感的關系及其表達*

何承誠 謝裕安 毛賽蘭 黃正 閆雷 趙瑞強

目的：探討PLXNC1基因多態性與廣西肝癌遺傳易感性關系及表達。方法：以廣西20個肝癌高發家族（肝癌家族組79例）和10個健康對照家族（健康對照組40例）為研究對象，應用飛行時間質譜技術檢測兩組中PLXNC1基因rs2272335的基因型及等位基因頻率，免疫組織化學染色檢測PLXNC1在不同肝組織中的表達。結果：PLXNC1基因rs2272335位點健康對照組人群中攜帶C等位基因型的個體發生干細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的風險分別是T等位基因型個體的4.16倍（95%CI為0.37～47.3），差異有統計學意義（P=0.032）。核心成員組與肝癌患者組兩組間差異無統計學意義（P＞0.05）。PLXNC1基因rs2272335位點基因型TT、TC、CC在肝癌患者組人群、核心成員組人群、健康對照組人群三組間者差異無統計學意義（P＞0.05）。肝癌組織中，PLXNC1蛋白表達水平3.12±1.12顯著高于肝癌癌旁組織1.54±0.67和正常肝組織1.23±0.87（P＜0.05）。結論：PLXNC1基因rs2272335位點C等位基因型可能是廣西HCC發生的危險因素。PLXNC1過度表達與肝癌發生密切相關。

肝腫瘤 PLXNC1基因 單核苷酸多態性 遺傳易感性 表達

原發性肝癌（primary liver cancer，PLC），簡稱肝癌）是我國最常見的惡性腫瘤之一。廣西扶綏縣是我國肝癌高發區之一，2006年至2008年肝癌發病率為67.26/10萬［1］，肝癌占全部惡性腫瘤的57.01%，居惡性腫瘤的首位［2］。肝癌的發病具有明顯的家族聚集傾向，遺傳因素在家族聚集性肝癌中具有重要作用［3］。目前有關肝癌基因多態性與廣西扶綏肝癌家族遺傳易感性的研究已有部分報道［4］。PLXNC1基因位于第12染色體12q23上，屬于PLEXIN家族成員，其表達的PLXNC1蛋白（又稱為叢蛋白C1）主要構成是一種大分子的跨膜蛋白，主要功能是作為（semaphorins 7A，SEMA7A）受體參與細胞的黏附和轉移［5］。目前研究發現PLXNC1（NM-005761.1）在黑色素瘤和胰腺癌中都有拷貝數改變，在胰腺癌中有兩個突變缺失（c.1475 A＞T，p.N 492I與c.2554G＞A，p.E852K），并認為PLXNC1與黑色素瘤和胰腺癌發生發展密切相關［6］。王云等［7］研究發現PLXNC1基因與肝癌的發生發展密切相關，PLXNC1基因多態性在肝癌方面的研究鮮見報道。本研究以廣西扶綏肝癌高發家族為研究對象，探討PLXNC1基因多態性與廣西肝癌家遺傳易感性關系。采用免疫組織化學方法檢測PLXNC1蛋白在散發肝癌組織、癌旁組織和正常肝組織間表達水平差異，探討其在肝癌發生的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 基因多態性檢驗 肝癌高發家族（簡稱“肝癌家族”）是指在先證者的血緣直屬親屬中，至少有1例或1例以上的肝癌患者，要求所有肝癌患者均分布在三代之內（含先證者）的家族。健康對照家族組是指扶綏當地與肝癌高發家族居住在同一個村莊，無血緣關系的家族。

本研究以20個肝癌家族（肝癌家族組79例）和10個對照家族（健康對照40例）為研究對象，均為廣西扶綏縣壯族人群。肝癌家族組由肝癌患者（簡稱肝癌患者組）及其有血緣關系的直系親屬（簡稱核心成員組）組成，其中肝癌患者為2003年1月至2011年10月在廣西醫科大學附屬腫瘤醫院進行外科手術的患者，術后經病理檢查確診，術前未經放療、化療或生物治療，均經病史采集顯示其直系親屬中至少已有1人確診為肝癌。肝癌家族組79例中男性45例，女性34例，中位年齡44（16～86）歲；HBsAg（+）50例，HBsAg（-）29例；AFP（+）14例，AFP（-）65例；吸煙17例，不吸煙（＜10支/日）60例；飲酒64例，不飲酒（＜100 g/日）12例。

健康對照家族組（簡稱健康對照組）選自在當地縣腫瘤醫院進行健康體檢的家系人群，體檢結果均正常。無肝炎病史、腫瘤病史及遺傳病史。40例中男性26例，女性14例，中位年齡47（16～85）歲。吸煙15例，不吸煙（＜10支/日）25例；飲酒17例，不飲酒（＜100 g/日）23例。肝癌患者直系親屬（59例）及正常對照組（40例）均經知情同意后采集晨起空腹靜脈血液5 mL。按照國家人類基因組研究倫理學準則進行，所有入選者均知情并同意參加本研究。兩組間研究對象的年齡、性別比無明顯差異，具可比性。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器 血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒（北京天根生物科技有限公司），IlexR Gold Reagent Kit試劑盒、MassARRY Assay De?signer 3.1 software、MassARRAY Samsung Nanodis?penserRS1000點樣儀、MassARRAY Analyzer Compact質譜系統（美國Sequenom公司），PCR擴增引物、單堿基延伸引物（深圳華大基因公司）。PLXNC1山羊單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；即用型SP免疫組織化學染色試劑盒（福州邁新生物有限公司）。

1.2.2 免疫組織化學染色檢驗 50例肝癌組織癌旁組織標本取自廣西醫科大學附屬腫瘤醫院2011年1月至2013年12月期間經手術治療的HCC患者，其中男性41例，女性9例，年齡30～75歲，中位年齡47歲。病理類型均為肝細胞癌，所有正常肝組織標本取自廣西壯族自治區人民醫院病理科，選擇相同時間段肝組織正常黏膜切片40例作為正常對照組，其中男性32例，女性8例，年齡35～70歲，中位年齡為46歲。所選擇的HCC病例均經外科手術治療，并經過術后病理證實。所有HCC病例均無其他嚴重內科疾病或伴發其他惡性腫瘤，若合并其他部位轉移者予以剔除。

1.2.3 SNP功能位點篩選 利用互聯網開放的數據庫，從國際人類基因組單體型圖計劃（International HapMap Consortium）HapMap數據庫（http：//hapmap. ncbi.nlm.nih.gov/）下載PLXNC1基因的所有SNPs的基因分型數據。

利用Haplo View程序（http：//www.broadinstitute.org/ scientific community/science/programs/medical- andpopulation-genetics/haploview/haploview）進行詳細的分析。利用SNPs功能預測網站（http：//manticore. niehs.nih.gov/snpfunc.htm）挑選PLXNC1基因功能位點rs2272335作為研究靶點。

1.2.4 DNA提取 實驗分析PLXNC1基因型的基因組DNA，是北京天根生化科技有限公司生產試劑盒，提取從手術切除的癌組織（20例）標本的DNA。采用血液DNA提取試劑盒提取肝癌患者直系親屬（59例）及正常對照組（40例）靜脈血液標本的DNA，經分光光度計定量，OD值為1.7～2.1認定DNA純度合格。將質檢合格的DNA濃度調整到50 μg/μL，置于-20℃冰箱保存備用。

1.2.5 基因型分析 深圳華大基因公司的SEQUE?NOM實驗平臺，采用美國SEQUENOM Mass ARRAY時間飛行質譜技術分析所有研究對象DNA的SNP的基因分型，以TYPER 4.0軟件分析實驗結果，獲得分型數據。

1.2.6 引物設計及合成引物設計 應用美國Seque?nom公司AssayDesigner 3.1 software設計并經深圳華大基因公司合成，每個SNP位點對應兩條PCR擴增引物和一條延伸引物。PCR上游引物為5’-GCTTCT ATATGTGGTGTCTTCTTA-3’，下游引物為5’-GCCTT CTATATGTGGTGTCTTCTTG-3’，延伸引物為5’-GC CTTCTATATGTGGTGTCTTCTT-3’，引物均由深圳華大基因公司合成。

1.2.7 PCR擴增及芯片點樣 使用熱啟動Taq酶（美國Agena Bioscience公司），在384孔板上，常規擴增待測片段（40個循環），然后在PCR產物中加入2 μL堿性酸化酶SAP（美國SEQUENOM）消化液（雙蒸水1.53 μL，hME緩沖液0.17 μL，SAP 0.474 μL），以除去未用盡dNTP，消化反應（37℃60 min；85℃10 min）。然后根據SEQUENOM程序進行引物延伸反應和延伸產物純化反應，用納升點樣儀（美國MassARRAY Samsung NanodispenserRS1000 SEQUENOM）將純化后的產物分點在質譜微陣列芯片SpectroCHIP上（美國Agena Bioscience）［8］。

1.2.8 飛行時間質譜技術（MALDI-TOF MS）檢測SNP位點 采用Sequenom Massarray平臺對Rac 1基因進行SNP分型，TYPER 4.0軟件分析實驗結果，獲得分型數據。根據引物延伸反應產物質譜峰的位置確定其分子質量，從而得出SNP基因分型結果；同一種顏色可以對應2個或3個峰值，分別為SNP位點的延伸引物峰及兩個等位基因峰，若該位點屬于純合子，則僅存在1個等位基因峰，若為雜合子，則存在2個等位基因峰［8］。

1.2.9 免疫組織化學檢測及判定標準 PLXNC1蛋白表達陽性染色主要定位于細胞邊緣以及質膜下的細胞質內，呈棕黃色顆粒狀。在400倍鏡下根據肝細胞邊緣或腫瘤細胞胞漿染色程度進行分析評分。染色程度可分為4級：染色與陰性對照相同者計0分；染色呈淡黃色者（弱陽性者）計1分；染色呈較深褐色者（中等陽性）計2分；染色呈較深褐色者（強陽性）計3分。依照陽性細胞范圍可分為：無陽性細胞數計0分；0%～10%計1分；11%～50%計2分；51%～75%計3分；＞75%計4分。染色指數（STAINING INDEX，SI）=染色陽性比例評分+染色強度評分。最后以SI評定PLXNC1蛋白表達水平。

1.3 統計學方法

應用SPSS 21.0統計軟件對數據進行統計學分析。以χ2檢驗比較兩組年齡、性別、基因型和等位基因分布頻率的差異。采用擬合優度χ2檢驗法進行對照組基因型分布的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，判斷研究對象是否具有人群代表性。用χ2檢驗和非條件Logistic回歸分析法計算比值比（OR）及95%可信區間（95%CI）。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 基因型檢測結果

本研究119例樣體基因分型的檢測結果顯示PLXNC1基因rs2272335位點存在TT、TC、CC三種基因型，其中TT基因型106例、TC基因型11例、CC基因型2例（圖1）。

圖1 PLXNC1（rs2272335）SNP位點基因型分型圖Figure 1 Map of PLXNC1（rs2272335）SNP Genotype

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

為了檢驗PLXNC1基因rs2272335位點基因型的頻率是否遵循遺傳平衡定律，在健康對照組中進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗。結果表明，基因型頻率的觀察值與期望值之間的差異無統計學意義（P＞0.05），提示其PLXNC1基因rs2272335位點基因型頻率符合遺傳平衡，具有廣西壯族人群代表性（表1）。

2.3 PLXNC1基因rs2272335位點多態性與廣西肝癌家族聚集遺傳易性的關系

肝癌家族組PLXNC1基因rs2272335位點等位基因T與C在肝癌家族肝癌患者組中的分布頻率分別為95%和5%，在肝癌家族核心成員組中的分布頻率分別為89.83%和10.17%。在健康對照家族組中的分布頻率分別為98.75%和1.25%。PLXNC1基因rs2272335位點健康對照組人群中攜帶C等位基因型的個體發生HCC的風險分別是T等位基因型個體的4.16倍（95%CI為0.37～47.3），差異有統計學意義（P=0.032）。肝癌家族核心成員組與肝癌家族肝癌患者組兩組間差異無統計學意義（P＞0.05）。

PLXNC1基因rs2272335位點肝癌患者組中TT、TC、CC基因型分布頻率分別為90%、10%、0。核心成員組中TT、TC、CC基因型分布頻率分別為83.05%、 13.56%、3.39%。健康對照家族組中TT、TC、CC基因型分布頻率分別為97.5%、2.5%、0。家族核心成員組人群中攜帶TC基因型的個體發生HCC的風險分別是TT基因型個體的0.68倍（95%CI為0.13～3.52），但差異無統計學意義。健康對照家族組人群中攜帶TC基因型的個體發生HCC的風險分別是TT基因型個體的4.3倍（95%CI為0.37～50.95），但差異無統計學意義（表2）。

2.4 PLXNC1蛋白在肝癌組織、癌旁組織、正常肝組織中表達

PLXNC1蛋白陽性染色主要定位于細胞邊緣以及質膜下的胞質內，呈棕黃色顆粒狀。免疫組織化學結果表明PLXNC1在肝癌組織中呈中度陽性反應，癌旁組織中呈弱陽性反應，正常肝組織中呈陰性反應（圖2）。

肝癌組織、癌旁組織和正常肝組織中PLXNC1蛋白表達水平（SI）分別為3.12±1.12、1.54±0.67和1.23± 0.87。三組間PLXNC1表達水平經ANOVA檢驗，有顯著性差異（P＜0.05）。兩兩比較顯示，肝癌組織中PLXNC1蛋白表達水平顯著高于肝癌癌旁組織和正常肝組織（P＜0.01）；肝癌癌旁組織中PLXNC1蛋白表達水平高于正常肝組織蛋白表達，但差異無統計學意義（P=0.067，表3）。

表1 PLXNC1基因rs2272335位點基因型Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗 例Figure 1 Hardy-Weinberg equilibrium test for genotype frequencies of PLXNC1 gene（rs2272335） n

表2 PLXNC1基因rs2272335位點多態性基因型與肝癌易感性的關系 例Figure 2 Risk evaluation of the PLXNC1(rs2272335)genotype on HCC development n

?圖2 PLXNC1在肝癌組織，癌旁組織和正常肝組織中的表達（S-P×400）Figure 2 PLXNC1 protein ex?pression in different liver tissues（S-P×400）

表3 PLXNC1蛋白在各種肝組織中的表達水平的比較Figure 3 Comparison of PLXNC1 protein expression among different liver tissues

3 討論

研究表明單核苷酸多態性（SNP）在人群中發生頻率＞1%，可能會造成攜帶者對疾病易感性的改變［9-11］。目前研究發現PLXNC1（NM_005761.1）在黑色素瘤和胰腺癌中都有拷貝數改變，在胰腺癌中有兩個突變缺失（c.1475 A＞T，p.N 492I與c.2554G＞A，p.E852K）［6］。這些均提示PLXNC1基因位點多態性與肝癌發生顯著相關。

在肝癌發生的多階段過程中，基因多態性可影響肝癌發生的易感性，對其進行篩查、鑒別有助于預測肝癌高危人群［12-13］，腫瘤標志物有助于提高肝癌的生存率和臨床治療效果［14］?；仡櫼酝奈墨I，未發現PLXNC1基因rs2272335位點的研究，關于PLXNC1基因rs2272335位點與肝癌遺傳易感性的研究也屬首次。本研究首次探討了PLXNC1基因rs2272335位點多態性與廣西扶綏縣壯族人群中肝癌家族的聚集的遺傳易感性的關系。研究結果顯示與肝癌家族肝癌患者比較，正常健康對照人群中攜帶C等位基因型的個體發生HCC的風險分別是T等位基因型個體的4.16倍（95%CI為0.37～47.3），差異具有統計學意義（P=0.032）。以上結果表明PLXNC1基因rs2272335位點等位基因C是HCC發生的危險因素。PLXNC1基因rs2272335位點位于RNA的轉錄剪接體（NM_ 005761.2）位置上，此研究結果與前人研究發現PLXNC1（NM_005761.1）在黑色素瘤和胰腺癌中有拷貝數改變結果相似［6］。

本研究發現，PLXNC1蛋白主要定位于細胞邊緣以及質膜下的細胞質內，呈棕黃色顆粒狀。這與以前的研究相似［15］，PLXNC1蛋白位于細胞質膜的部位與其同信號分子相結合，符合其功能性多分子復合物組織者的定位。本研究檢測到PLXNC1蛋白在肝癌組織、癌旁組織、正常肝組織中的表達水平呈遞減趨勢。肝癌組織中PLXNC1蛋白表達顯著高于癌旁組織和正常肝組織（P＜0.01），與以往認為PLXNC1蛋白在黑色瘤中低表達不一致［16-17］。肝癌組織中PLXNC1蛋白表達高于正常肝組織，說明PLXNC1蛋白在肝細胞轉化或癌變的早期階段即有表達水平的增加。PLXNC1蛋白在肝癌組織、癌旁組織、正常肝組織中的表達呈遞減趨勢，提示PLXNC1過度表達是肝癌形成及進展密切相關的早期分子事件，即PLXNC1過度表達與肝癌發生密切相關。這驗證了PLXNC1基因位點多態性與廣西肝癌遺傳感性可能顯著相關。

因本研究收集的病例數較少，且健康對照數也偏少，因此，需擴大樣本數量進一步深入探討。PLXNC1多態性研究局限于廣西扶綏縣的壯族人群，故仍需進一步擴大樣本例數，在不同地域、不同人群中加以研究。

綜上所述，本研究初步探討了PLXNC1基因rs2272335位點多態性與廣西扶綏壯族肝癌家族聚集的遺傳易感性關系，結果發現PLXNC1基因rs2272335位點C等位基因型可能是廣西扶綏家族聚集性肝癌發生的危險因素，PLXNC1過度表達與肝癌發生密切相關。本研究為了解肝癌的發病機制及肝癌高危人群的篩檢提供實驗佐證，還應進行更深入的研究。

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（2015-04-09收稿）

（2015-05-20修回）

（編輯：周曉穎）

Relationship of PLXNC1(rs2272335)polymorphism with genetic susceptibility to primary liver cancer among family clusters in Guangxi and its expression

Chengcheng HE,Yu'an XIE,Sailan MAO,Zheng HUANG,Lei YAN,Ruiqiang ZHAO
Department of Experimental Research,Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China;Graduate School of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China.
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81260320)and Innovation project of Guangxi Graduate Education(No.YCBZ2013012).

Yu'an XIE;E-mail:gxxya@aliyun.com

Objective:To investigate the correlation between plexinC1(PLXNC1)rs2272335 polymorphism and the family clustering genetic susceptibility to primary liver cancer(PLC)in Guangxi and the expression of PLXNC1.Methods:Genotype and alleles of rs2272335 were determined in 20 liver cancer family groups(79 cases)and 10 healthy normal control groups(40 cases)in Fusui County through Time of Flight Mass Spectrometer.Immunohistochemistry detected the PLEXNC1 protein expression.Results:For the alleles of PLXNC1(rs2272335)site,the risk of hepatocellular carcinoma(HCC)for individuals with[C]allele was 4.16-fold(95%CI= 0.37-47.3,P=0.032)compared with that for individuals with[T]allele among the members of the healthy normal control group.The frequencies of the[C]and[T]alleles were similar in the HCC patients and the core individuals of liver cancer families(P＞0.05).For the genotype of the PLXNC1(rs2272335)site,the differences in frequencies of TT,TC,and CC genotypes were not statistically significant among the PLC patients and the core individuals of the liver cancer families and normal controls.The PLXNC1 protein expression in HCC(3.12±1.12)was higher than in hepatocellular paracancerous tissues(1.54±0.67)and in benign hepatocellular lesions(1.23±0.87) (P＜0.05).Conclusion:The[C]allele of PLXNC1(rs2272335)site might be the risk gene for the occurrence of PLC family clustering in Guangxi.PLXNC1 protein overexpression was closely correlated with PLC oncogenesis.

liver neoplasm,PLXNC1 gene,single nucleotide polymorphism,genetic susceptibility,expression

10.3969/j.issn.1000-8179.20150397

廣西醫科大學研究生學院，廣西醫科大學附屬腫瘤醫院實驗研究部（南寧市530021）

*本文課題受國家自然科學基金資助項目（編號：81260320）和廣西研究生教育創新計劃資助項目（編號：YCBZ2013012）資助

謝裕安 gxxya@aliyun.com

日期：2015-6-30

http：//www.cnki.net/kcms/detail/12.1099.R.20150630.1527.001.html

何承誠 專業方向為腫瘤的早期診斷及治療。

E-mail：jake1976@163.com