響應面法優化小麥胚芽蛋白逆流脈沖超聲輔助提取技術

顧 婕 馬海樂 何榮海 劉雪姣

（江蘇大學食品與生物工程學院江蘇省農產品物理加工重點實驗室，鎮江 212013）

響應面法優化小麥胚芽蛋白逆流脈沖超聲輔助提取技術

顧 婕 馬海樂 何榮海 劉雪姣

（江蘇大學食品與生物工程學院江蘇省農產品物理加工重點實驗室，鎮江 212013）

研究小麥胚芽蛋白的超聲輔助提取工藝。以脫脂小麥胚芽為原料，采用堿溶酸沉－逆流脈沖超聲復合法提取其中的蛋白質，考察超聲提取時間、料液溫度、脈沖超聲占空比、料液比等單因素對提取率的影響，確定出各因素最適取值范圍；進一步采用響應面法優化工藝條件，得到小麥胚芽蛋白質提取最佳工藝：超聲總時間為20 min，超聲溫度50℃、料液比為0.087 g/mL（1∶12）、占空比為0.625；研究表明，在此工藝條件下，蛋白質提取率為86.59%，較傳統的一次堿提酸沉法提取率提高了49.06%。

超聲提取 小麥胚芽 響應面法

2012年我國小麥產量超過1.2億t，約占糧食總產量的20%［1］。小麥胚芽是整個麥粒中營養價值最高的部分，脫脂麥胚（Defatted wheat germ）是小麥胚芽制油后的殘留物，含有大量優質蛋白以及谷胱甘肽等一些生理活性物質［2］，可被應用于增補食品中的蛋白質、強化食品中的氨基酸［3］，還是一種制備活性多肽的重要原料。

國內外很多研究人員利用堿溶酸沉法從脫脂小麥胚芽中分離出蛋白質［4－7］。就小麥胚芽而言，因為含有約30%的淀粉，在提取過程中導致體系黏度增加，影響了蛋白質的酸沉，回收率下降；同時在沉淀過程中許多淀粉也會隨之沉淀，致使蛋白純度較低。為此，馬海樂等［8］建立了“堿提＋α淀粉酶水解＋酸沉淀”分離小麥胚芽蛋白的新方法，使得小麥胚芽蛋白的純度和提取率顯著提高。但是蛋白質的總得率還不很高，分析原因發現主要問題出現在堿提這一過程。為此，本研究提出利用逆流脈沖模式的超聲波在堿提環節促進蛋白質的溶解，進一步提高蛋白質的提取率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥胚芽：河南省鯤華生物技術有限公司；α淀粉酶、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉及其他分析試劑：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

FBTQ2000超聲輔助提取/反應設備：無錫泛博生物工程有限公司；DDS738單相電子電能表：上海華立電表廠；UDK149全自動凱氏定氮儀：意大利VELP公司；877 Titrino plus自動電位滴定儀：瑞士Metrohm公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 小麥胚芽蛋白超聲輔助堿提基本工藝

稱取50 g脫脂小麥胚芽粉按料水比1∶10（m/V）配制，加入5 g NaCl，用1mol/LNaOH將溶液pH調至11.0，超聲輔助提取一定時間。隨后在5 000 r/min條件下離心20 min，取上清液。將上清液pH調至6.5，按酶與底物比為0.3%添加α淀粉酶，在50℃水浴中水解1 h，隨后沸水浴滅酶10 min，調pH值至4.0，待白色沉淀完全后，離心20 min，取沉淀，60℃恒溫干燥10 h，得到粗小麥胚芽蛋白。

超聲輔助提取/反應設備為本課題組自主研制的逆流聚能探頭式超聲設備，逆流循環速度控制在150 r/min，料液溫度維持恒定。超聲探頭功率的測定為使用單相電子電能表測定超聲1 h電表讀數，測得實際功率為464 W。

1.3.2 超聲輔助提取單因素試驗設計

研究提取時間、料液溫度、脈沖超聲占空比、料液比4個單因素對小麥胚芽蛋白提取的影響。

提取時間：在料液比為1∶10、料液溫度為50℃、占空比0.625的前提下，設定提取時間為10、20、30、40、50 min。

料液溫度：在料液比為1∶10、占空比0.625、提取時間為最佳值的前提下，設定料液溫度為20、30、40、50、60℃。

脈沖超聲占空比的影響：在料液比為1∶10、提取時間和料液溫度為上一步確定的最佳值的前提下，設定占空比為 0.417（10∶14 s）、0.5（10∶10 s）、0.625（10∶6 s）、0.714（10∶4 s）、0.833（10∶2 s）。

料液比：在提取時間、料液溫度和占空比為最佳值的前提下，設定料液比為1∶6、1∶8、1∶10、1∶15、1∶20。

1.3.3 響應面試驗設計方案

在單因素試驗基礎上，采用方差分析篩選出對蛋白質提取率影響較大的因素，采用Box－Behnken模型設計優化試驗方案。

1.3.4 粗蛋白質質量分數測定和提取率計算

粗蛋白質量分數參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》凱氏定氮法，蛋白質換算系數為5.83。蛋白質的提取率計算：

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 提取時間對提取率的影響

超聲提取時間對蛋白質提取率和質量分數的影響如圖1所示。

圖1 不同超聲提取時間下的蛋白質量分數和提取率

由圖1可知，超聲提取20 min蛋白質的提取率和質量分數就達到一個較高的水平。隨著提取時間的延長，蛋白質含量基本穩定，而且40 min后開始下降；而提取率有一定幅度的增長，到了40 min后也開始下降。組利用原子力顯微鏡觀察超聲波對酪蛋白以及玉米蛋白結構影響研究時發現，在處理前期，蛋白質顆粒迅速細化，一定時間之后開始出現分子聚集現象，主要原因在于處理前期超聲波因為振動引起蛋白顆粒疏松，傳質效果改善；到了后期，超聲波開始導致蛋白質疏水鍵外露，疏水性增加，溶出的蛋白分子出現聚集，溶解度變差［9－11］。20 min之后蛋白質質量分數基本穩定，盡管提取率還在增加，但幅度很小，所以選取超聲提取時間為20 min。

2.1.2 料液溫度對提取率的影響

料液超聲溫度對蛋白質提取率和質量分數的影響如圖2所示。

圖2 不同超聲溫度下的蛋白質量分數和提取率

由圖2可知，隨著溫度升高，蛋白質提取率逐步增高，在50℃達到最大值，隨后下降。分析原因，隨著溫度升高，體系中各組分之間充分接觸，增加了超聲所引起的熱效應和空化效應，便于蛋白質從組分中脫離，蛋白質的提取率得到增高。另一方面，隨著溫度增高，部分蛋白質隨之變性，影響了蛋白質的溶解性，使之提取率下降，同時也會導致蛋白質營養性質的破壞［12－13］。由超聲的物理特性可知，隨著溫度的增加，表面張力系數（σ）及黏滯系數（η）下降，空化閾值下降，使空化泡的產生變得容易，空化效應加強，引起提取率上升；但當溫度進一步增加，蒸汽壓（Pv）增高幅度增加，空化強度或空化效應下降，導致提取率下降［14］。選擇50℃為最佳提取溫度。

2.1.3 脈沖超聲占空比對提取率的影響

占空比是指1 min內，超聲作用時間所占的比例。占空比反映的是超聲波連續工作的時間［15］。占空比對蛋白質提取率和質量分數的影響見圖3。

如圖3所示，低占空比條件下提取率較低，主要原因是相對于工作時間而言間歇時間過長，不僅是液體受到超聲處理的絕對時間較短，更重要的是上一個脈沖施加給處理對象的應力已經完全恢復，才受到再次超聲脈沖的沖擊，因此促溶效果不很顯著。隨著占空比增加，超聲波實際發射超聲波信號的時間得到延長，空化效應增強［16］，提取率和質量分數也有所增加，在占空比達到0.625即超聲時間工作10 s，間歇6 s時，提取率和質量分數達到最大值；再增加占空比就使得反應體系內溫度增高，蒸汽壓（Pv）增高幅度增加，空化強度或空化效應下降，導致提取率下降。據此，最佳提取占空比為0.625。

圖3 不同超聲占空比下的蛋白質量分數和提取率

2.1.4 料液比對提取率的影響

由圖4可知，隨著料液比減小，小麥胚芽蛋白提取率先增加后降低，在料液比為1∶10的時候提取率達到最高。這是因為隨著料液比的減小，溶劑量加大，溶解溶質的能力自然增加。但隨著料液比的進一步下降，溶液愈來愈稀，其黏滯系數η和表面張力系數σ降低，導致超聲波要求的空化閾值雖然減少，但是空化泡崩潰時伴隨產生的最大溫度Tmax與最大壓力Pmax值也會降低，空化效果降低，因此提取率降低［17］。而蛋白質質量分數隨著料液比增加逐步增加，趨于平衡。由于料液比增加需要的生產成本也會增加，所以選擇料液比1∶10比較合適。

圖4 不同料液比下的蛋白質量分數和提取率

2.2 響應面設計及結果分析

根據單因素試驗結果，超聲輔助提取時間在20 min，溫度為50℃，料液比為1∶10，超聲占空比為0.625時小麥胚芽蛋白提取率最大。通過SPSS單因素分析，溫度、料液比、占空比對提取率影響較大，選擇這3個因素進行響應面優化，超聲提取時間固定為20 min。試驗因素和水平見表1，試驗設計以及結果見表2。

表1 Box－Benhnken中心組合設計的因素和水平表

表2 Box－Benhnken試驗設計及結果

2.2.1 數值模型方程

用Design－Expert8.0.6軟件對表2中數據進行多元回歸擬合，建立蛋白提取率（Y）的二階響應回歸模型，進而分析各試驗因素X對于響應值Y的影響。小麥胚芽蛋白提取率的回歸方程如下：

2.2.2 回歸與方差分析

回歸模型方差分析結果見表3。

表3 方差分析表結果

由表3可知，模型P＜0.000 1，本研究所得回歸模型極其顯著。模型Radj2＝0.953 3，該模型可以解釋95.33%響應值的變化，因此模型與實際擬合較好。模型一次項X1，X2，二次型X12對響應值蛋白質提取率Y影響極其顯著（P＜0.000 1）；二次型對響應值影響顯著（P＜0.05）；3個因素對蛋白質提取率影響依次為X2＞X1＞X3，即料液比＞超聲溫度＞超聲占空比；交互項X1X2對蛋白質提取率的影響顯著；X1X3，X2X3對蛋白質提取率的影響不顯著；結果表明，各因素對小麥胚芽蛋白質提取率影響不是簡單的線性關系。

2.2.3 響應面因素交互作用分析

圖5 各因素交互作用對提取率影響的響應面及等高線圖

圖5為各個因子交互作用的響應面3D和等值線分析圖。從響應面的最高點和等值線可以看出，在所選的范圍內存在極值，既是響應面的最高點，同時也是等值線最小橢圓的中心點［18］。由圖5a可知，蛋白質提取率隨著料液比和溫度呈現增加后下降的趨勢，等高線逐步呈現橢圓形，說明X1X2交互作用較強，編碼值較大的X1和X2的響應值較低，可能是因為隨著溫度和料液比增加，溶劑體系內部滲透壓達到了動態平衡，且伴隨著熱效應產生，蛋白質發生變形，從而提取率降低［19］。由圖5b可知，隨著溫度和占空比增加，蛋白質提取率均呈現先上升后下降趨勢，二者等高線是圓形，說明X1X3交互不明顯。由圖5c可知，隨著料液比和占空比增加，蛋白質提取率有緩慢下降趨勢，二者等高線是明顯圓形，X2X3交互不明顯。

2.2.4 數值模型驗證

通過響應面軟件分析得出小麥胚芽蛋白提取最佳條件為：超聲溫度49℃、料液比為0.087 g/mL（1∶12）、占空比為0.609，蛋白質提取率的預測值為87.18%。將最佳條件修正為溫度50℃、料液比為0.087 g/mL（1∶12）、占空比為 0.625即超聲 10 s，間歇6 s，在此條件下提取小麥胚芽蛋白，實際提取率為86.59%，產品中蛋白質量分數為68.90%，提取率與理論預測值相比相對誤差＜5%。因此，該模型能較好預測實際小麥胚芽蛋白質提取率，有實用價值。

2.2.5 對照試驗及結果分析

根據1.3.1方法采用不加超聲的傳統堿溶酸沉提取方法進行小麥胚芽蛋白的提取試驗，將20 min的超聲波輔助提取改為30 min的磁力攪拌提取，將試驗結果與本研究最佳條件下所得結果進行對照。傳統一次堿提酸沉所得到的麥胚蛋白提取率為58.09%，蛋白質質量分數為72.24%。相比之下，采用超聲輔助提取法蛋白質的提取率提高了49.06%，因此是一種可取的方法。

3 結論

采用堿溶酸沉－逆流超聲復合法提取麥胚蛋白，結果證明超聲作用效果明顯，蛋白質提取率得到明顯提高。試驗表明影響蛋白質提取率的因素順序為料液比＞超聲溫度＞超聲占空比。在單因子試驗基礎上，將響應面方法應用到逆流超聲輔助提取小麥胚芽蛋白的提取工藝的優化。在總超聲時間20 min下，確定了最佳工藝條件：超聲溫度50℃、料液比為 0.087 g/mL（1∶12）、占空比為 0.625。響應面的預測值為87.18%。蛋白質實際提取率為86.59%，較傳統的一次堿提酸沉法提取率提高了49.06%。

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Optimization of Ultrasonic Extraction of Protein from Defatted Wheat Germ by Response Surface Methodology

Gu Jie Ma Haile He Ronghai Liu Xuejiao
（Jiangsu Provincial Key Laboratory for Physical Processing of Agricultural Products，Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013）

The study was aimed to establish an optimized method by ultrasonic pretreatment to prepare DWGP.In the experimentof the paper，protein isolates have been prepared from defatted wheatgerm（DWG）by alkaline extraction and isoelectric precipitation combined with ultrasonic pretreatment.Ultrasonic time，ultrasonic temperature，pulsemode and solid－to－solvent ratiowere inspected respectively as every single factor to determine the optimal value for experiment.Then Response Surface Methodology（RSM）was used to optimize extraction conditions to calculate maximum extraction efficiency.The results showed that the optimum extraction conditions were：ultrasonic time of 20 min，ultrasonic temperature at50℃，solid－to－solvent ratio at1∶12，pulsemode as10 s on and 6 s off.On the conditions，the average protein recovery was86.59%，which almost fitted themodel calculation value 87.18%.Compared with traditional alkaline extraction and isoelectric precipitation，the protein recovery was increased by 49.06%.

ultrasonic extraction，defatted wheat germ，response surfacemethodology

TS210.9

A

1003－0174（2015）08－0019－05

公益性行業（農業）科技專項（201303071），國家863計劃（2013AA102203）

2014－03－24

顧婕，女，1989年出生，碩士，食品物理加工

馬海樂，男，1963年出生，教授，食品物理加工