嗜熱棲熱菌海藻糖合酶的分子改造及其應用*

宿玲恰，張悅，吳敬

1(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

2(江南大學生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

海藻糖是由兩個吡喃葡萄糖通過半縮醛羥基縮合，以α-1，1-糖苷鍵連接而成的非還原性二糖，廣泛存在于微生物、植物和昆蟲中［1-3］。海藻糖具有穩定的化學性質，能夠有效保護生物膜和生物大分子，從而維持生命體的生命過程和生物特征。2000年7月，Nature中有關海藻糖評價專文提出:“海藻糖的存在與否關系著很多生命的生存或者死亡”。海藻糖還能夠作為生物和醫學領域中生物活性物質的優良保護劑和穩定劑。因此，海藻糖以其獨特的理化性質和功能在食品加工業、醫藥業、農業、生化制品業和化妝品業等多個領域中具有廣泛的應用前景［1，4-5］。

在海藻糖的制備方面，人們投入了大量精力對其制備工藝進行研究，并尋求簡單有效的生產方式。目前，海藻糖的制備方法主要包括天然生物提取法、化學合成法、微生物發酵法和酶轉化法。酶轉化法又分為海藻糖合酶法、磷酸化酶法以及麥芽寡聚糖基海藻糖合成酶和麥芽寡聚糖基海藻糖水解酶雙酶法［6-8］。其中，海藻糖合酶(Trehalose synthase，簡稱 TreS，EC 5.4.99.16)是一類分子內轉糖苷酶，能夠催化麥芽糖一步轉化為海藻糖，具有成本低廉、轉化工藝簡單和產物易于分離提取等優勢，為目前海藻糖制備方法的研究方向［9-10］。

海藻糖合酶來源于多種微生物，包括常溫菌和嗜熱菌。通常情況下，常溫菌來源的酶的最適反應溫度為25～35℃，最適pH 6.5～8.0。當采用該類酶制備海藻糖時，由于酶的作用環境適合于多種微生物生長，常常易受到雜菌污染，消耗反應底物和產物，造成原料浪費，同時使得反應體系pH難以控制，影響酶催化活性和穩定性。而嗜熱菌來源的酶的最適溫度一般高于60℃，并且在60～80℃、pH 5.5～9.5條件下仍然保持較好的穩定性，因此有利于通過提高酶反應溫度減少微生物污染，避免損失［10-13］。

本研究團隊前期研究中克隆表達了來源于嗜熱棲熱菌的海藻糖合酶，并優化了該酶催化麥芽糖制備海藻糖的酶轉化工藝，但轉化率僅有49.0%(數據將在《基因組學與應用生物學》雜志2015年第34卷發表)。本文通過定點突變，獲得了催化性能提升的海藻糖合酶突變體，為其進一步工業化規模制備和應用奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 菌種與質粒

E.coli JM109、E.coli BL21(DE3)、質粒 pET24a(+)-TreS為本實驗室保藏。

1.2 主要試劑

瓊脂糖、Prime STAR? HS DNA聚合酶和DpnI，TaKaRa(大連)公司;質粒提取試劑盒，天根(北京)生化科技有限公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、卡那霉素(Kan)，生工生物工程(上海)股份有限公司;蛋白質凝膠電泳試劑盒和蛋白分子量標準品，碧云天生物技術(上海)有限公司;高效液相色譜柱Syncronis Amino Column(4.6 mm ×250 mm)，Thermo Scientific公司(美國);蛋白胨和酵母粉，Oxoid公司(英國);麥芽糖、海藻糖和葡萄糖等分析純試劑，國藥集團(北京)。

1.3 工程菌的構建

以質粒 pET-24a(+)-TreS為模板，通過一步PCR獲得突變體 P251L。正向引物(P251L-F):5＇-ATGTGGCCGGAGGAGACCCTGCCCTACTTCGGGGAC-3＇，反 向 引 物 (P251L-R):5＇-GTCCCCGAAGTAGGGCAGGGTCTCCTCCGGCCACAT-3＇。通過核酸電泳驗證PCR擴增產物，利用Dpn I降解模板后，轉化E.coli JM109，在LB瓊脂固體培養基上培養8～10 h，挑取單克隆于LB液體培養，抽提質粒進行序列測定。將含突變正確的基因的質粒轉化至E.coliBL21(DE3)中，從而獲得重組表達海藻糖合酶突變體的基因工程菌。

1.4 培養基和培養條件

1.4.1 培養基

LB培養基(g/L):NaCl 10，蛋白胨10，酵母粉5，卡那霉素0.03，pH 7.0。

TB 培養基(g/L):蛋白胨12，KH2PO416.4，酵母粉24，K2HPO42.3，甘油5，卡那霉素0.03，pH 7.0。

1.4.2 培養條件

種子培養:將保藏于-80℃的甘油管中吸取20 μL菌液接種至含30 μg/mLKan的LB培養基中，于200 r/min、37℃恒溫搖床中培養8～10 h。

搖瓶發酵:將種子液以5%接種量接至含30 μg/mL Kan的 TB培養基中，于37℃、200 r/min培養至OD600值達到 1.5，加入終濃度為 0.05 mmol/L的IPTG進行重組蛋白的誘導表達。

1.5 海藻糖的制備

1.5.1 海藻糖合酶轉化條件的研究

用Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液配制一定濃度的麥芽糖底物溶液，取10 mL裝于50 mL具塞三角瓶中，然后加入一定量的酶液，置于水浴搖床中以150 r/min進行酶反應，定時取樣，沸水浴10 min，并以12 000 r/min離心10 min后，將上清液用0.22 μm濾膜過濾，稀釋，利用HPLC檢測(見1.6.4)反應產物中海藻糖的生成量。

1.5.2 海藻糖轉化率計算(公式1)

1.6 分析方法

1.6.1 大腸桿菌細胞光密度(OD600值)的測定

用去離子水作為空白對照，利用蛋白核酸定量儀測定經過適當稀釋的菌液在波長600 nm下的吸光度值，OD600=讀數×稀釋倍數。

1.6.2 細胞破碎

收集重組菌發酵液，于12 000 r/min離心10 min后，棄去上清液，然后加入等體積磷酸緩沖液(20 mmol/L，pH 7.0)將菌體徹底懸浮。利用超聲波細胞粉碎機破碎細胞 (工作條件:φ 6工作探頭，時間15 min，工作3 s間歇2 s，功率25%)，進而于12 000 r/min離心15 min，收集上清液即為海藻糖合酶酶液。

1.6.3 海藻糖合酶酶活力測定

將稀釋一定倍數的酶液與用磷酸緩沖液(20 mmol/L，pH 7.0)配制的0.1 g/mL麥芽糖溶液均勻混合，置于60℃反應30 min后，沸水浴15 min將酶滅活以終止反應，然后通過HPLC檢測(見1.6.4)反應液中海藻糖的生成量。

酶活單位定義:在上述反應條件下，每分鐘生成1 μmol海藻糖所需的酶量定義為1個酶活力單位(U)。

1.6.4 海藻糖含量的HPLC分析

采用日立L-2000高效液相色譜儀檢測海藻糖含量。HPLC檢測條件為:NH2柱(APS-2 HYPERSIL，Thermo Scientific)，柱溫40℃，流動相為80%乙腈水溶液，流速0.8 mL/min，示差折光檢測器。

2）季節溫差產生的溫度作用比較大，但是在工程實際中由于基礎的變形會釋放到一部分作用，在計算中應考慮，否則會大幅度提高用鋼量。

1.6.5 SDS-PAGE蛋白電泳分析

使用購自碧云天生物技術有限公司的試劑盒進行SDS-PAGE蛋白電泳膠的制備，濃縮膠和分離膠的濃度分別為5%和12%，采用Tris-HCl，pH 8.3緩沖體系，電泳膠采用考馬斯亮藍G250(0.1%)染色。

2 結果分析

2.1 海藻糖合酶突變位點的選擇

本研究從NCBI中搜索嗜熱菌來源的、并且與本團隊前期從嗜熱棲熱菌基因組獲得的海藻糖合酶氨基酸同源性為98%～99%的海藻糖合酶氨基酸序列，經過多重序列比對，發現第251位點處氨基酸較為特殊。一方面，該位點非常保守，除了本團隊獲得的海藻糖合酶在該位點處為Pro，其他海藻糖合酶均為Leu(圖1)。另一方面，以Mycobacterium smegmatis海藻糖合酶(PDB編號3zo9)為模板，利用SWISS-MODEL在線軟件對本團隊獲得的海藻糖合酶空間結構進行模擬，發現該位點位于α-螺旋末端，由于Pro在二級結構中具有終止螺旋的作用，并且該螺旋一端的loop結構與活性中心相連(圖2)，可能對其催化功能產生不利影響。因此，本研究嘗試將該251位點的Pro突變為Leu，從而提高該位點附近結構穩定性，阻擋底物流失，提高轉化率。

圖1 不同嗜熱菌來源的海藻糖合酶多重序列比對Fig.1 Partial sequence alignments of trehalose synthase from different Thermus

圖2 嗜熱棲熱菌海藻糖合酶空間結構模擬圖Fig.2 Structure simulation of the T.thermophilus trehalose synthase

2.2 海藻糖合酶的定點突變和誘導表達

通過一步PCR法進行定點突變獲得了突變體P251L，經DNA測序驗證突變成功，進一步以E.coli BL21(DE3)為宿主菌進行突變體的表達，在37℃培養溫度下經搖瓶發酵28 h時OD600值為6.9，海藻糖合酶酶活達到最高值為6.9 U/mL(圖3)。經SDSPAGE分析，在理論值大小106 kDa附近出現明顯目的條帶(圖4)。

圖3 搖瓶發酵重組菌生長情況及產酶情況Fig.3 The cell growth of recombinant E.coli and production of trehalose synthase

2.3 海藻糖合酶突變體制備海藻糖的工藝優化

2.3.1 初始pH對海藻糖制備的影響

圖4 重組大腸桿菌發酵制備海藻糖合成酶的SDS-PAGE的分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant trehalose synthase

為了探究初始pH對海藻糖合酶突變體制備海藻糖的影響，利用不同pH(6.0～8.0)的20 mmol/L磷酸緩沖液配置0.3 g/mL的麥芽糖底物溶液，然后加入一定量的海藻糖合酶突變體在40℃下進行酶反應。從圖5a可知，當初始pH在6.0～7.5范圍內，轉化率隨pH的升高從40.2%逐漸提高至59.4%。當初始pH為7.5和8時，海藻糖合酶的轉化率均為59.4%。本研究選擇初始pH7.5繼續開展其他條件對制備海藻糖影響的研究。

2.3.2 溫度對海藻糖制備的影響

溫度是影響海藻糖制備的一個重要因素，將反應體系初始pH設置為7.5，其他反應條件不變，考察不同反應溫度(30～60℃)對海藻糖的制備影響。如圖5b所示，當反應溫度為50℃時，轉化率最高，達到62.0%。此外，還考察了在50℃其他pH條件下的轉化率情況，發現轉化率均低于62.0%。前期研究發現天然海藻糖合酶的最適反應溫度為40℃，但該溫度較適合多種微生物生長，易造成微生物污染，導致麥芽糖和海藻糖的消耗，以及微生物生長代謝引起的pH下降等問題，使得酶失活進而轉化率降低。突變體的最適反應溫度為50℃，降低了微生物生長代謝帶來的弊端，在海藻糖制備的實際應用中具有較大優勢。

2.3.3 加酶量對海藻糖制備的影響

加酶量直接影響到生產成本，當酶促反應體系初始pH為7.5，反應溫度為50℃，保證其他的反應條件不變，加酶量為5～30 U/g麥芽糖時，如圖5c可知，當加酶量為5～20 U/g時，麥芽糖酶轉化率隨加酶量的增加而逐漸提高，當加酶量達到20 U/g麥芽糖時，轉化率達到62.0%，繼續增大加酶量，轉化率不再繼續上升，因此選擇加酶量20 U/g麥芽糖，有利于降低工業成本，同時保證較高的轉化率。

2.3.4 底物濃度對海藻糖制備的影響

將酶促反應體系初始反應pH設置為7.5，反應溫度設置為50℃，加酶量為20 U/g麥芽糖，在底物質量濃度分別為0.1～0.6 g/mL下進行酶反應實驗。結果如圖5d所示，當底物質量濃度在0.1～0.5 g/mL范圍內，轉化率非常接近，分別為61.5%，62.0%，62.0%，61.9%和61.3%。然而，底物質量濃度高于0.6 g/mL時，轉化率稍有下降，為54.4%。因此，總體而言，底物質量濃度對海藻糖制備的影響不大，在實際應用中，在較高底物質量濃度下進行酶反應，有利于提高生產強度，減少生產成本。

2.4 采用工業級麥芽糖制備海藻糖的研究

在上述研究獲得了海藻糖制備最優條件的基礎上，本文進一步探究了利用工業級麥芽糖制備海藻糖的情況。麥芽糖通常從淀粉水解獲得，此過程會產生一定的葡萄糖，從生產成本角度考慮，在海藻糖的工業化生產中，所使用的麥芽糖均含有一定量的葡萄糖。有報道顯示，以含有葡萄糖的底物進行酶促反應可能會因葡萄糖的抑制作用導致轉化率下降［12-13］。因此，本研究考察了分別以含有0～0.07 g/mL葡萄糖的0.3 g/mL麥芽糖為底物的酶反應情況。如圖6所示，當葡萄糖含量為0～0.05 g/mL時，轉化率均保持在61.5% ～62.0%;葡萄糖含量為0.06 g/mL和0.07 g/mL時，轉化率分別為61.0%和60.2%。因此，當底物中含有0.01 g/mL～0.07 g/mL葡萄糖時，轉化率相差不大。

進一步分別用國藥、羅蓋特(中國)精細化工有限公司以及江蘇省奧谷生物科技有限公司生產的麥芽糖(葡萄糖含量分別為0，0.01，0.03 g/mL)為底物，制備海藻糖，轉化率分別為61.8%，61.8%和61.4%。由此可知，以工業級麥芽糖為底物制備海藻糖，對突變體的酶轉化率影響很小，具備工業化具備海藻糖的潛力。

圖6 葡萄糖含量對海藻糖生產的影響Fig.6 Effect of lactose concentration on trehalose production

3 結論

本團隊前期工作中獲得了一種嗜熱棲熱菌來源的海藻糖合酶，但其催化制備海藻糖的轉化率較低。在本研究中，通過定點突變技術將其進行了分子改造，獲得了突變體P251L，并在E.coli中進行了重組表達。進一步優化了該突變體制備海藻糖的轉化條件，獲得了最優反應條件為:初始pH為7.5，溫度為50℃，加酶量為20 U/g麥芽糖，轉化率達到最高值為62.0%，比天然酶提升了13.0%。此外，研究還發現，不同底物質量濃度(0.1～0.5 g/mL)和少量的葡萄糖(0～0.07 g/mL)對酶反應無明顯影響。該研究對于完善海藻糖合酶的催化性能和功能優化提供了一定的借鑒意義，今后可繼續對海藻糖合酶進行分子改造，進一步提升其催化轉化制備海藻糖的應用性能，從而為海藻糖的工業化制備奠定基礎。

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