解淀粉芽孢桿菌F1對黃曲霉的拮抗條件優化及其抑霉特性研究*

饒勝其，陳素雅，魏永峰，高璐，尹永祺，楊振泉，方維明

(揚州大學食品科學與工程學院，江蘇揚州，225127)

黃曲霉(Aspergillus flavus)是一種常見的霉菌，是子囊菌亞門(Ascomycotina)、曲霉屬(Aspergillus)常見的腐生型好氧真菌。黃曲霉的次生代謝產物黃曲霉毒素是一類以二呋喃環(毒性作用)和氧雜萘鄰酮(致癌作用)為基本結構的化合物，迄今已報道B1、B2、G1、G2、M1、M2和毒醇等 20 種，其中黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)的毒性和致癌性最強。黃曲霉毒素廣泛存在于農產品和食品中［1-3］。目前，防治黃曲霉及其毒素污染的重要手段是使用抗生素及化學制劑，但隨之導致耐藥性產生及抗生素殘留等問題。隨著人們對農作物產品質量和安全性的日益重視，生物防治正在逐步取代抗生素和化學制劑。芽孢桿菌已是重要的農業生防菌，其產生的抗真菌物質主要包括脂肽類抗生素Surfactin、Iturin和Fengycin等和蛋白類幾丁質酶、葡聚糖酶等［4-5］，具有較強的廣譜抗真菌活性。許多研究發現，解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)在生長過程中可以產生一系列抑制真菌和細菌活性的代謝物，已證實的抑菌物質包括抑菌蛋白類、脂肽類抗生素、大環類酯類、肽類、聚酮化合物等，在抑制病原菌、環境保護、動物生產等方面已顯示出益生菌的用途［6-10］。

在我們前期研究中，從黑胡椒中分離出1株對黃曲霉有較強抑制作用的菌株F1(保藏號CGMCC No.10942)，依據菌株的形態特征、培養特征、生理生化特征結合16S rDNA基因序列分析、系統發育樹構建鑒定菌株為解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens，命名為B.amyloliquefaciens F1。而且，研究已證實菌株F1的抑菌成分為分子質量為30 k～100 ku的蛋白類物質，具有良好的pH穩定性和熱穩定性。在本研究中，擬從以下兩方面展開:(1)對B.amyloliquefaciens F1的發酵培養基和培養條件進行初步優化，以期提高其黃曲霉抑制能力;(2)考察B.amyloliquefaciens F1發酵液對黃曲霉生長及產毒的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.2 菌株

B.amyloliquefaciens F1，產毒黃曲霉，由揚州大學食品微生物發酵實驗室從海南黑胡椒體表分離純化。

1.1.3 主要試劑

KNO3、蔗糖、D-果糖、可溶性淀粉、乙腈(色譜純)、正己烷、異戊醇，國藥集團化學試劑有限公司;Glycine，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.4 主要儀器、設備

ZHJH-C1209B型垂直流超凈工作臺，上海智誠分析儀器制造有限公司;GHX-92708-1型隔水式恒溫培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司;TG-16WS臺式高速離心機，湘儀離心機儀器有限公司;SS-325高壓蒸汽滅菌鍋，日本TOMY公司;液相色譜，日本島津公司;CAR/PDMS SPME萃取頭，上海安譜科學儀器有限公司。

1.1.5 培養基

營養肉湯培養基:蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉 5 g，K2HPO42 g，檸檬酸二銨 2 g，乙酸鈉 5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g ，MnSO4·4H2O 0.25 g，加入蒸餾水，定容至1 000 mL，調pH至6.2～6.4，121 ℃滅菌15 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株F1生長曲線測定

將凍存于-20℃冰箱中的B.amyloliquefaciens F1細菌保種管在4℃解凍，吸取100 μL菌液轉接于含100 mL營養肉湯的300 mL錐形瓶中，30℃搖床(140 r/min)振蕩培養30 h，其中，每隔2 h取樣進行平板涂布，倒置培養24 h后菌落計數。

1.2.2 菌株F1抗菌培養條件單因素優化

1.2.2.1 培養溫度對F1發酵液抑菌活性的影響

分別吸取100 μL菌液轉接于含100 mL營養肉湯的300 mL 錐形瓶中，25，28，30，32，35，37 ℃ 搖床(140 r/min)振蕩培養48 h后，測定發酵液抑菌活性。

1.2.2.2 培養基初始pH值對F1發酵液抑菌活性的影響

營養肉湯配制好后，分別調pH值至5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0 后高壓滅菌，按 1.2.2.1 的方式接種，30℃搖床(140 r/min)振蕩培養48 h后，測定發酵液抑菌活性。

1.2.2.3 培養時間對菌株F1抑菌效果的影響

按1.2.2.1的方式接種，自然pH值，30℃搖床(140 r/min)振蕩培養，取培養不同時間(24，36，48，60，72 h)的發酵上清液，測定發酵液抑菌活性。

1.2.3 菌株F1抗菌培養基成分優化

(1)碳源。以營養肉湯為基礎空白對照培養基(自然pH與1.2.2.2的優化結果相同，故無需再調節pH)分別添加0.1%的葡萄糖、蔗糖、D-果糖、乳糖和可溶性淀粉，按1.2.2.1的方式接種，32℃搖床(140 r/min)振蕩培養48 h測定發酵液抑菌活性。

(2)氮源。以營養肉湯為基礎空白對照培養基，分別添加0.1%的酵母抽提物、胰蛋白胨、檸檬酸銨和硝酸銨，按1.2.2.1的方式接種，32℃搖床(140 r/min)振蕩48 h培養測定發酵液抑菌活性。

(3)微量元素。以營養肉湯為基礎空白對照培養基，分別添加一定量的微量元素MnSO4·4H2O(22.3 mg/L)、ZnSO4·7H2O(22.3 mg/L)、CuSO4·5H2O(0.025 mg/L)、FeSO4·7H2O(27.8 mg/L)、Mg-SO4·7H2O(440 mg/L)、KNO3(190 mg/L)、甘氨酸(2.0 mg/L)、L-谷氨酸(2.0 mg/L)，按 1.2.2.1 的方式接種，32℃搖床(140 r/min)振蕩培養48 h測定發酵液抑菌活性。

(4)最佳成分單因素試驗。已篩選出最佳碳源蔗糖、氮源檸檬酸銨、微量元素硝酸鉀，以營養肉湯為基礎空白對照培養基，分別添加 0.2%，0.4%，0.6%，0.8%和1.0%的蔗糖，0.1%，0.2%，0.3%，0.4%和0.5%的檸檬酸銨，95，190，285，380，475 mg/L的 KNO3，按濃度從高到低編組號 2、3、4、5、6，空白對照組為1號。按1.2.2.1的方式接種，32℃搖床(140 r/min)振蕩培養48 h測定發酵液抑菌活性。

1.2.4 菌株F1發酵液對黃曲霉生長及產毒的影響

取B.amyloliquefaciens F1接種入優化后的培養基(0.4%蔗糖、0.2%檸檬酸銨、0.02%KNO3，初始pH值5.5)中，32℃，發酵培養48 h，8 000 r/min離心20 min，取上清液過0.22 μm水系濾膜，依次使用膜截留分子質量分別為100 ku和30 ku的超濾離心管進行超濾處理(4 000 g，4℃，離心45 min)，收集30 k～100 ku的超濾液，即為菌株F1超濾抗菌液。

黃曲霉孢子懸液制作方法同1.2.5，調整濃度至106個/mL。每個錐形瓶加入PDA(馬鈴薯葡萄糖液體培養基)150 mL，高壓滅菌后放至室溫，每個錐形瓶加入300 μL黃曲霉孢子懸液，空白對照組未加入B.amyloliquefaciens F1超濾抗菌液，其余兩組分別加入10%和20%的超濾抗菌液，每組設3個平行，150 r/min，30℃搖瓶培養，3 d后測定菌絲干重，5 d后測定黃曲霉毒素。

1.2.5 霉菌孢子懸浮液制備

將保存在PDA斜面培養基上的霉菌接種到PDA平板，28℃培養箱內培養4 d后，加入無菌PBS緩沖液，滅菌大槍頭尖頭輕刮培養基上的孢子，然后將含有霉菌孢子和菌絲的混懸液通過滅菌八層紗布的藍蓋瓶中以過濾掉霉菌菌絲，渦旋振蕩，10倍稀釋法分別稀釋10、100、1 000倍后，血球計數板計數，然后將計數好的霉菌孢子原液用無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)緩沖液統一調整至105個/mL，4℃冰箱貯藏備用。

1.2.6 抑菌率測定

將菌株F1接種入營養肉湯中按照一定條件進行發酵培養，發酵結束后，6 000 r/min離心10 min，收集上清液，采用0.22 μm聚醚砜樹脂(PES)水系濾膜過濾除菌。吸取1 mL無菌上清液傾注至無菌平板內，倒入10 mL PDA培養基輕輕混勻，待培養基冷卻凝固，用直徑為6 mm打孔器在中央打孔，向孔中注入20 μL濃度為104個/mL的黃曲霉孢子懸液，空白培養基代替上清液作為對照，30℃培養3 d后測霉菌直徑，每組3個平行，以抑菌率(%)表示拮抗細菌上清液的抑菌效果，計算公式為:

1.2.7 菌絲干重測定

參照左瑞雨等［11］的方法，采用PDA培養基搖瓶培養黃曲霉孢子3 d后，大量菌絲已長出，中速定性濾紙過濾培養液，蒸餾水沖洗3遍以除去培養基黏性成分，過濾得到的菌絲連同濾紙放入大號平皿中(濾紙和平皿提前烘干至恒重并稱重)，90℃干燥烘干至恒重，之后將菌絲放入干燥器中充分干燥至恒重，則黃曲霉菌絲質量為干燥后的總體質量與干燥前平皿與濾紙質量之差。

1.2.8 黃曲霉毒素含量測定

毒素提取及濃度檢測參照許艷麗等［12］的方法，進行適當改進。具體步驟如下:將1.2.1.1中培養了5 d的培養液按1.2.1.2的方法過濾，收集濾液，準確量取15 mL過濾液于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋振蕩1 min，重復3次后，5 000 r/min離心5 min，取上清液10 mL過多功能凈化柱，從多功能凈化柱的收集池內轉移3 mL凈化液到棕色具塞小瓶中60℃ ±1℃氮氣吹干，分別加入200 μL正己烷和100 μL三氟乙酸，密閉混勻60 s后，在40℃ ±1℃烘箱中衍生15 min。樣品衍生后于室溫下氮氣吹干，采用600 μL 水-乙腈(85%/15%)溶解，3 000 r/min離心15 min，取上清液過膜到進樣瓶中供測定用。

色譜條件:色譜柱，RP-C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);柱溫，20℃;流動相，乙腈(色譜純)+水;熒光檢測器激發波長，360 nm;發射波長，440 nm;進樣量，10 μL;流速，5 mL/min。梯度洗脫如下:0 ～10 min，15%～40%乙腈;10～28 min，40%乙腈;28～30 min，40%～15%乙腈。

1.2.9 數據統計分析

采用SPSS 13.0軟件對數據進行統計分析，用Duncan’s多重分析進行組間顯著性檢驗，顯著水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 菌株F1生長曲線

如圖1所示，新保種的F1在營養肉湯中30℃搖瓶培養，2 h即進入對數生長期，之后快速生長，14 h后進入穩定期，此時菌落總數達到5.2×107CFU/mL，到30 h時仍保持在高生物量。

圖1 B.amyloliquefaciens F1生長曲線圖Fig.1 The growth curve of B.amyloliquefaciens F1

2.2 菌株F1抗菌培養條件單因素優化

2.2.1 培養溫度對F1發酵液抑菌活性的影響

解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)所屬芽孢桿菌(Bacillus)，其最適生長溫度為28～30℃［13］，但微生物最適生長溫度不一定就是目標產物代謝最佳溫度。值得說明的是，前期研究已證實菌株F1的抑菌成分為分子量30 k～100 ku的蛋白類物質，具有良好的熱穩定性，在溫度70℃以下處理30 min，其活性完全不受影響(相關系列數據已投稿其他雜志)。在本研究中，選取25～37℃考察不同溫度對B.amyloliquefaciens F1抑菌蛋白合成的影響，如圖2所示，隨著培養溫度的上升，F1發酵液抗菌活性先升后降，在32℃達到最高，后逐漸下降;其生物量呈先上升趨勢，32℃后變化較小。因此，F1產抗菌物質最佳培養溫度為32℃。

圖2 培養溫度對B.amyloliquefaciens F1發酵液抑菌活性的影響Fig.2 The influences of cultural temperature to B.amyloliquefaciens F1 broth’s antifungal activity

2.2.2 初始pH值對F1發酵液抑菌活性的影響

解淀粉芽孢桿菌的最適生長pH值為6.5～7.0［13］，但微生物最適生長pH不一定就是目標產物代謝最佳pH。此外，前期研究已證實菌株F1所分泌抗真菌蛋白在pH值5.0～8.0，其相對抗菌活性均在80%以上，其中弱酸性環境對其抗真菌活性影響不大。培養基初始pH影響菌體自身生長和代謝物的產生，菌株F1產抑菌物質受培養基初始pH的影響如圖3所示，在pH為5.5的培養基中培養，菌株F1上清液的抗菌活性最高;相比堿性環境，弱酸性環境更有利于菌F1的生長。上述結果表明，微酸性環境更有利于F1產抗菌物質。

圖3 培養pH對B.amyloliquefaciens F1發酵液抑菌活性的影響Fig.3 The influences of cultural pH to B.amyloliquefaciens F1 fermentation broth’s antifungal activity

2.2.3 培養時間對F1發酵液抑菌活性的影響

由圖4可知，隨著培養時間的延長，B.amyloliquefaciens F1菌體生物量及發酵液抑菌活性不斷增加，48 h后，菌體生物量及抑菌活性變化較小，可見抗菌物質隨F1菌體的生長代謝不斷積累，累積曲線類似典型的細菌生長S曲線，進一步說明了抗菌物質為F1的體外代謝產物，且穩定存在于菌液中。為經濟節約，選取48 h為F1產抗菌物質為最佳培養時間。

圖4 培養時間對B.amyloliquefaciens F1發酵液抑菌活性的影響Fig.4 The influences of cultural time to B.amyloliquefaciens F1 fermentation broth’s antifungal activity

綜上，菌株F1產抗真菌蛋白的適宜培養條件為:溫度32℃，初始pH值5.5，培養時間48 h。

2.3 B.amyloliquefaciens F1抗菌培養基優化

2.3.1 碳源

B.amyloliquefaciensF1在添加了同一濃度不同種類碳源的培養基中培養后，發酵上清液對黃曲霉的抑制效果如圖5所示，與對照組相比，添加碳源對生物量的影響變化不大，OD600值均在2.1～2.3;添加碳源(包括長效大分子淀粉和速效小分子的果糖和葡萄糖)能普遍提高B.amyloliquefaciens F1的抑菌效果，蔗糖能使同等條件下的抑菌率由46.5%提高到65.5%，淀粉其次，為55.5%。因此，本批試驗所選擇的5種碳源中，選取蔗糖為最佳碳源。

圖5 碳源對B.amyloliquefaciens F1發酵液抑菌活性的影響Fig.5 The influences of cultural carbon to B.amyloliquefaciens F1 fermentation broth’s antifungal activity

2.3.2 氮源

由圖6可知，與對照組相比，添加不同氮源對菌F1的生物量影響不大，OD600值均在2.1～2.3;在試驗選取的4種氮源中，檸檬酸銨能有效提高B.amyloliquefaciens F1產抑菌物質的能力(P＜0.05)，使得上清液對黃曲霉的抑制能力從46.5%提高到62.0%。

圖6 氮源對B.amyloliquefaciens F1發酵液抑菌活性的影響Fig.6 The influences of cultural cnitrogen to B.amyloliquefaciens F1 fermentation broth’s antifungal activity

2.3.3 微量元素

由圖7可知，根據各不同元素適宜添加濃度添加到培養基后，與對照組相比，各添加組中B.amyloliquefaciens F1生物量變化不大，OD600值均在2.0～2.3;菌F1發酵液抑菌活性有不同程度升高，其中K+能顯著增加F1拮抗性能(P＜0.05)，故選取KNO3作為最佳微量元素進一步做單因素優化試驗。

圖7 微量元素對B.amyloliquefaciens F1發酵液抑菌活性的影響Fig.7 The influences of cultural trace elements to B.amyloliquefaciens F1 broth’s antifungal activity

2.3.4 培養基成分單因素

本研究根據已確定的最佳培養基成分，從中心濃度出發，設定相關不同濃度下F1發酵上清液對黃曲霉真菌抑制活性。由圖8可知，碳源蔗糖的最適添加濃度為3號試驗組的0.4%，氮源檸檬酸銨的最適添加濃度為3號試驗組的0.2%，硝酸鉀的最適添加濃度為3號試驗組的1.90 mg/mL。綜上，B.amyloliquefaciens F1產抗菌物質的適宜發酵培養基為:在營養肉湯培養基中添加0.4%蔗糖、0.2%檸檬酸銨和0.02%硝酸鉀。優化后B.amyloliquefaciens F1發酵上清液對黃曲霉的抑菌率達到75.2%，比優化前提高了60.1%。

圖8 蔗糖、檸檬酸銨、硝酸鉀濃度對B.amyloliquefaciens F1發酵液抑菌活性影響Fig.8 The influences of different levels of sugar，ammonium and citrate to B.amyloliquefaciens F1 broth’s antifungal activity

2.4 菌株F1對黃曲霉菌絲生長的影響

由表1可知，預設兩組試驗組黃曲霉菌絲質量均低于僅接種黃曲霉孢子的對照組，分別降低了14.8%和35.7%，且加入20%F1抗菌超濾液的培養液中的菌絲質量顯著低于對照組，研究表明菌株F1所產抗菌蛋白能夠通過抑制孢子萌發而達到抑制黃曲霉生長的能力。本試驗在滅菌的PDA培養液中加入了濃度為106個/mL的黃曲霉孢子，由圖9可知，加入了所篩拮抗菌B.amyloliquefaciens F1抗菌超濾液后，黃曲霉的生長受到一定程度抑制，菌絲抱團生長現象減弱，菌絲球變小，且抑制程度隨著加入的超濾液的量的增加而增加。

表1 黃曲霉菌絲質量Table 1 Weight of Aspergillus flavus mycelius

圖9 錐形瓶中黃曲霉生長情況Fig.9 The growth situation of Aspergillus flavus mycelius in conical flasks

2.5 B.amyloliquefaciens F1對黃曲霉產毒的影響

將黃曲霉孢子懸液接種入PDA液體培養基中，同時加入不同蛋白終濃度的F1上清超濾液，進行搖瓶培養，5 d后采用HPLC對發酵液中的黃曲霉毒素AFB1進行定性定量分析。AFB1標準品色譜圖如圖10所示，保留時間為11.3 min，根據不同標準品濃度和峰面積求得回歸方程和相關系數，得到AFB1標準曲線方程為:Y=0.016 6x+0.089 3，相關系數R2=0.998 4。

圖10 AFB1標準品色譜圖Fig.10 The chromatogram map of AFB1 standard

圖11 空白組黃曲霉發酵液樣品(A)、10%F1超濾液黃曲霉發酵液樣品(B)和20%F1超濾液黃曲霉發酵液樣品(C)HPLC色譜圖Fig.11 (A)The chromatographic graph of Aspergillus flavus fermentation sample blank group;(B)The chromatographic graph of Aspergillus flavus fermentation sample within 10%ultrafiltrate;(C)The chromatographic graph of Aspergillus flavus fermentation sample within 20% ultrafiltrate

表2 培養液中黃曲霉毒素含量Table 2 AFB1 contents of Aspergillus flavus fermentation samples

由圖11和表2可知，未添加抗菌超濾液的黃曲霉培養組AFB1含量最高，達到267.5 mg/L，而添加10%超濾液后，AFB1濃度減少了84.45%，添加20%超濾液的則未有真菌毒素檢出。研究表明，菌株F1上清超濾液有效抑制了AFB1的生物合成。Farzaneh等［14］從伊朗開心果中分離鑒定了1株枯草芽孢桿菌UTBSP1，能夠顯著降低營養肉湯培養基和開心果中的AFB1，其降解率分別為85.66%和95%。張志敏等［15］從秦川牛瘤胃內容物中分離鑒定了1株巨大芽孢桿菌WZ-2，在含有500 μg/mL的 AFB1發酵培養基中培養72 h，可使AFB1降解率達到79%。上述研究顯示了某些芽孢桿菌能夠通過生物作用直接降解AFB1，很可能是產生了能降解AFB1的胞外蛋白酶。在本研究中，F1上清超濾液對黃曲霉菌絲生長有顯著抑制作用，很可能是通過抑制孢子萌發和菌絲生長而影響黃曲霉毒素的生物合成，而F1對黃曲霉毒素AFB1是否具有降解作用有待后續研究進一步探索。

3 結論

(1)為了提高B.amyloliquefaciens F1發酵液中抗菌物質的產量，以抑菌活性為檢測指標，通過單因素試驗對B.amyloliquefaciens F1培養條件和培養基成分進行了優化。結果表明，B.amyloliquefaciens F1的適宜培養條件為溫度32℃，初始pH值5.5，培養時間48 h;適宜發酵培養基為在營養肉湯培養基中添加0.4%蔗糖、0.2%檸檬酸銨和0.02%KNO3。

(2)以菌絲干重、菌絲形態為考核指標，研究發現B.amyloliquefaciens F1的發酵上清的超濾液(30 k～100ku)顯著抑制了黃曲霉孢子萌發和菌絲生長。通過HPLC對黃曲霉毒素AFB1的定性定量檢測，研究發現B.amyloliquefaciens F1發酵上清的超濾液(30 k～100 ku)顯著抑制了AFB1的產生，很可能是通過抑制黃曲霉孢子萌發和菌絲生長而達到降低AFB1產量的目的。B.amyloliquefaciens F1的發酵液對黃曲霉毒素的降解作用及能有效降解黃曲霉毒素的成分有待進一步的研究。

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