全細胞催化合成L-苯基乳酸重組大腸桿菌的構建*

王穎，范銘，薛素妹，錢凱，齊斌，朱益波

1(吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春，130118)

2(常熟理工學院生物與食品學院，蘇州市食品生物技術重點實驗室發酵工程技術研究中心，江蘇常熟，215500)

苯基乳酸(phenyllactic acid，PLA)，即2-羥基-3-苯基丙酸，是一種應用廣泛的手性化合物［1-3］。近年來，研究發現PLA對大多數食源性致病細菌和真菌具有廣譜而高效的抗菌活性［4-7］，引起食品行業普遍關注。PLA作為乳酸菌苯丙氨酸的代謝產物，對人體和動物細胞均無毒性［8-10］，是一種天然生物防腐劑。此外，它還具有溶解性好和熱穩定性高、有效pH范圍寬、使用方便等優點，有利于其未來在食品工業的普遍應用［11-14］。

L-苯基乳酸(L-phenyllactic acid，L-PLA)作為PLA兩種手性對映異構體［15］中的一種，具有特殊的生物活性，可以作為手性中間體廣泛應用于化工、醫藥、農藥和生物合成等領域［16］。采用聚苯基乳酸替代礦物類工程塑料有助于減少礦物能源消耗和溫室氣體排放［17］。目前微生物轉化合成D-PLA和L/DPLA消旋體［18-20］的研究較多，攜帶 Lactobacillus plantarum subsp.plantarum基因D-ldhY52V突變體的重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhD由于關鍵位點基因突變導致重組菌轉化能力明顯提高至77%摩爾轉化率［21］。ZHENG［22］報道用凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans SDM)全細胞生產苯基乳酸產量高達37.3 g/L，轉化率為70%。Leuconostoc mesenteroides ATCC 8293［23］生長細胞轉化合成D-PLA最大值35 mmol/L，轉化率高達75.2% ～83.3%。但目前報道D-PLA合成的文獻較多，關于L-PLA合成的報道較少，且產量和光學純度仍不理想。采用高效便捷的方法合成高光學純度是L-PLA大量投入應用的前提。而生物催化因其高效和高度的立體選擇性，成為手性合成最重要的方法之一。

乳酸脫氫酶是微生物合成PLA的一種關鍵酶，但由于微生物細胞內乳酸脫氫酶的表達受到嚴格調控，限制苯基乳酸合成［24］。因此，利用基因工程手段獲得高效過表達乳酸脫氫酶的重組菌是提高苯基乳酸產量的有效途徑。本研究構建了1株能夠高效表達L-乳酸脫氫酶的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhL，此重組菌具有較高的還原苯丙酮酸(phenylpyruvic acid，PPA)生產L-PLA能力，可為進一步提高微生物合成PLA的產率、光學純度和底物轉化率提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑

L-苯基乳酸、D-苯基乳酸和苯丙酮酸鈉，國藥集團;酵母提取物和胰蛋白胨，英國Oxoid公司;IPTG、DNA 聚合酶、DNA Marker、NADH(BBI)、X-Gal、硫酸卡那霉素、相關分子試劑盒、引物合成和DNA測序，上海生物工程公司;T4DNA連接酶、限制性內切酶，大連寶生物公司(TaKaRa);B-PER細菌總蛋白提取試劑，德國Thermo公司;所有實驗試劑如果無特殊說明均為分析純。

1.1.2 菌株、質粒和培養基

pMD19-T Simple Vector大連寶生物公司(TaKa-Ra);E.coli JM109，E.coli BL21(DE3)，pET-28a(+)均為實驗室保藏。

Luria-Bertani(LB)培養基:酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L。根據需要，在培養基中添加50 μg/mL的硫酸卡那霉素。

1.2 儀器與設備

PCR擴增儀、水平電泳系統、垂直電泳系統、凝膠成像系統、微孔板分光光度計，美國 Bio-RAD公司;高速臺式離心機，德國Thermo公司;恒溫金屬浴，德國 Eppendorf公司;高效液相色譜儀，日本島津公司;恒溫振蕩培養箱，太倉市華美生化儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 分子克隆

基因組DNA的提取純化、質粒DNA的提取純化、DNA酶切、連接和轉化、感受態細胞制備均參照文獻［25］。根據美國國家生物技術中心(National Center ofBiotechndogy Information，NCBI)中 已 知 的B.megaterium WSH-002 L-乳酸脫氫酶基因(1dhL)序列設計特異性引物。上游引物:5’-GCGCCCATATGATGAAAACACAATTTAC-3’;下游引物:5’-CCGGGATCCTTACACAAAAGCTCTG-3’。為了便于克隆與連接，上游引物5’設計了Nde I酶切位點，下游引物5’設計了BamH I酶切位點。

以巨大芽孢桿菌 B.megaterium Z2013513(CCTCC:M2013244)基因組為模板，對ldhL基因進行PCR擴增。PCR反應體系(50 μL):10×PCR Buffer 5 μL，上下游引物(10 pmol)各2 μL，Mg2+(25 mmol/L)3 μL，dNTP 1 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)1 μL，基因組模板 2 μL，滅菌超純水 36 μL。PCR 擴增條件為:94℃預變性5 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸90 s，進行25個循環，最后72℃終延伸10 min。

PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將膠回收的目的基因片段亞克隆到pMD19-T簡易載體，用T4DNA連接酶16℃連接過夜，轉化至感受態細胞E.coli JM109中，根據藍白斑篩選陽性克隆。通過雙酶切鑒定后，獲得陽性克隆子E.coli JM109/pMD19-T-ldhL，送往上海生工進行DNA測序。

1.3.2 重組表達質粒pET-28a-ldhL的構建

將克隆載體pMD19-T-ldhL經Nde I和BamH I雙酶切產物進行核酸電泳膠回收，獲得目的基因ldhL，連接至經Nde I和BamH I雙酶切的表達質粒pET-28a(+)，轉化到E.coli BL21(DE3)感受態細胞中，經質粒酶切和菌落PCR驗證，獲得重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-28a-ldhL。

1.3.3 目的基因的誘導表達

挑取 E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhL、E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)和 E.coli BL21(DE3)單菌落分別接種于10 mL LB液體培養基(含卡那霉素50 μg/mL)，37 ℃，200 r/min培養過夜。按1%的接種量(體積分數)轉接入100 mL LB培養基(含50 μg/mL卡那霉素)中，37℃，200 r/min培養至OD600值為0.4～1.0，添加IPTG至終濃度為1 mmol/L，于25℃，200 r/min誘導表達6 h。取誘導后菌液，8 000 r/min、4℃離心5 min，菌泥經超純水洗滌2遍后稀釋至OD600值為1，取1 mL稀釋液離心收集菌體，加入100 μL超純水和30 μL 5×上樣緩沖液，充分混勻后沸水浴加熱5 min，12 000 r/min、4 ℃ 離心 5 min，取10 μL上清進行SDS-PAGE分析。以12%的凝膠作分離膠，電泳結束后用考馬斯亮藍R250染色。經脫色液脫色后凝膠成像分析重組蛋白表達情況。

1.3.4 乳酸脫氫酶酶活力測定

誘導活化后的菌株E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)/pET-28a和E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhL經離心洗滌后稀釋至OD600值為1，取1 mL稀釋液離心收集菌體，加入500 μL B-PER試劑，充分混勻后30℃渦旋裂解10 min，12 000 r/min、4℃離心5 min，取適量上清液進行乳酸脫氫酶酶活測定。

乳酸脫氫酶活性測定參照文獻［26］并做適當修改，基本原理是鑒于NADH在340 nm處有最大吸收峰，通過光吸收峰值的改變定量測定酶的含量。酶活測定溫度 30℃，3 mL的反應體系:pH 7.0，100 mmol/L磷酸鈉緩沖液，含10 mmol/L苯丙酮酸鈉，0.4 mmol/L NADH和適量粗酶液。在30℃、pH 7.0條件下，每分鐘消耗1 μmol/L NADH所需的酶量為1個酶活單位(U/mL)。比酶活定義為:1 mg酶蛋白所含的酶活單位(U/mg)。蛋白質濃度測定方法:Bradford法［27］，以不同濃度的牛血清蛋白做標準曲線。

1.3.5 重組大腸桿菌全細胞轉化PPA合成L-PLA

菌體活化:從固體培養基上挑取E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhL單菌落接種至裝有10 mL新鮮LB培養基(含50 μg/mL卡那霉素)的100 mL三角瓶中培養，37℃、200 r/min過夜培養。

重組菌誘導及L-PLA合成:將活化好的重組菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhL按1%(體積比)的接種量接種至裝有100 mL新鮮LB培養基(含50 μg/mL卡那霉素)的500 mL三角瓶中，200 r/min、37℃培養至 OD600值為 1.2，加入誘導劑 IPTG至 0.2 mmol/L，25℃誘導6 h后，4℃、6 000 r/min離心5 min收集菌體。菌體用pH為7.0的磷酸鈉緩沖液洗滌2次，重懸于10 mL磷酸鈉緩沖液中，反應60 min后取500 μL轉化液經10 000 r/min，4℃離心5 min，上清進行HPLC檢測產物L-PLA和底物PPA物質的量濃度，菌泥進行OD600值檢測。

1.3.6 高效液相色譜分析方法

將轉化液離心，取上清液與流動相混合均勻，經0.22 μm濾膜過濾后采用HPLC檢測L-PLA物質的量和光學純度。PPA和L-PLA定量檢測條件:色譜柱為Bio-Rad Aminex HPX-87H;流動相為5 mmol/L稀硫酸;流速0.6 mL/min;柱溫30℃;進樣體積5 μL，檢測波長210 nm。L-PLA光學純度檢測條件為:手性柱OJ-RH，流動相:V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(三氟乙酸)∶V(去離子水)=50∶50∶1.5∶900，流速 0.3 mL/min，柱溫30℃，檢測波長210 nm，進樣量5 μL。

1.3.7 PPA摩爾轉化率計算［公式(1)］

2 結果與分析

2.1 ldhL基因克隆及重組質粒的構建

以B.megaterium Z2013513基因組為模板進行PCR擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增片段大小約1.0 kb，(如圖1A)，片段大小與預期相符。將PCR產物連接至克隆質粒pMD19-T簡易載體，經測序分析，ldhL基因長度為957 bp，表明已擴增到ldhL基因。重組表達質粒pET-28a-ldh L圖譜如圖2所示。重組克隆質粒pMD19-T-ldh L和重組表達質粒pET-28a-ldh L經Nde I和BamH I雙酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳分析結果分別如圖1B和圖3A，表明克隆質粒和表達質粒均構建成功。E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldh L菌落PCR電泳圖如3B，表明重組大腸桿菌能成功克隆并轉錄ldh L基因。

圖1 PCR擴增產物電泳圖(A);重組克隆質粒pMD19-T-ldhL(B)的酶切鑒定Fig.1 Electrophoresis of PCR amplification(A);Restrication analysis of recombinant cloning plasmid pMD19-T-ldhL(B)

圖2 pET-28a-ldhL質粒圖譜Fig.2 Map of recombinant plasmid pET-28a-ldhL

圖3 重組表達質粒pET-28a-ldhL的酶切鑒定(A);菌落PCR鑒定(B)電泳圖Fig.3 Restrication analysis of recombinant cloning plasmid pET-28a-ldhL(A);Electrophoresis of clone PCR verification(B)

2.2 ldhL基因的誘導表達及酶活測定

對經IPTG誘導后重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhL、E.coli BL21(DE3)/pET-28a 和原始菌株E.coli BL21(DE3)進行SDS-PAGE電泳分析，結果如圖4所示。與對照菌株相比，E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhL在約40 ku處有明顯條帶，除去質粒上融合表達的融合標簽，與預測目標蛋白大小一致，表明巨大芽孢桿菌ldhL在大腸桿菌中成功表達。

圖4 SDS-PAGE分析重組大腸桿菌L-乳酸脫氫酶蛋白表達Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant L-lactate dehydrogenase expression in E.coli

對E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhL粗酶液酶活和蛋白表達量進行測定，未檢測出對照菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a和 E.coli BL21(DE3)對 PPA的酶活，重組菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhL對PPA的比酶活為3.4 U/mg，說明重組ldhL在大腸桿菌中成功表達且對PPA顯示出催化活力。

2.3 重組菌全細胞轉化PPA合成L-PLA

全細胞轉化試驗表明E.coli BL21(DE3)/pET-28aldhL對PPA具有較強的轉化能力。在37℃、200 r/min條件下轉化60 min，70.32 mmol/L PPA經25 g/L(干重)重組大腸桿菌將全細胞轉化還原為50.59 mmol/L LPLA，底物摩爾轉化率為71.94%。HPLC檢測結果見圖5:此轉化體系不對稱還原PPA合成的L-PLA具有較高的光學純度(96.98%e.e.)，以上結果表明此一步生物轉化體系能高效地不對稱合成L-PLA。

圖5 HPLC分析重組菌全細胞轉化合成L-PLAFig.5 HPLC analysis of L-PLA production by whole cells of recombinant E.coli

3 結論

Rubrivivax benzoatilyticus JA2［28］可將 1 mmol/L L-苯丙氨酸轉化為 0.92 mmol/L L-PLA。1996年，Hashimoto［29］等從土壤中篩選1株假單胞菌(Pseudomonas sp.)，能將2-羥基3-苯基丙腈(3-phenyllactonitrile)轉化為e.e.值為75%的L-PLA。本研究通過構建過表達L-乳酸脫氫酶的重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhL，采用全細胞一步生物轉化法，將PPA高效不對稱還原成高光學純度L-PLA，為進一步提高微生物合成L-PLA的產率、光學純度和底物轉化率提供依據。

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