Thermobifida fusca葡萄糖異構酶在枯草桿菌中的表達*

鄧輝，陳存武，孫傳伯，韋傳寶

1(皖西學院 生物與制藥工程學院，安徽六安，237012)

2(六安市蛋白質分離與純化研究中心，安徽 六安，237012)

D-木糖異構酶(xylose isomerase XIase.EC 5.3.1.5)能可逆催化D-木糖和D-木酮糖之間的異構轉化，也能可逆催化D-葡萄糖為D-果糖之間的異構轉化，所以在食品工業中也被稱為葡萄糖異構酶(GI-ase)［1］。GIase 是高果糖漿(high fructosesyrup，HFS)工業的關鍵用酶，由于高果糖漿比蔗糖更有益于健康，并有著良好的發酵性能和適宜的口感，被越來越廣泛地應用在食品和飲料工業中。

為大幅提高GIase的產量和生產強度，將GIase的基因過量表達是最有效的途徑之一。常用的基因工程宿主菌有大腸桿菌、枯草桿菌以及酵母［2］。在本實驗室前期工作中，一種來源于嗜熱菌Thermobifida fusca的GIase基因xylA在E.coli中成功克隆表達，并進行了酶學性質和轉化率的分析，以葡萄糖為底物該酶的Km和Kcat值分別為190 mmol/L和35 s-1［3］，高的催化活力、高的轉化率將使該酶成為改進葡萄糖異構化食品工業過程中潛力巨大的候選者。然而大腸桿菌在過量表達外源蛋白時，易形成不溶性包涵體或聚集體，同時存在著可能對人體有害的內毒素?？莶輻U菌作為一種工業中應用廣泛的工程菌，在一些方面具有無可比擬的優勢［4-5］:首先，枯草桿菌是國際公認的食品安全菌株;其次，種屬間的密碼子偏好性不明顯;最后，同大腸桿菌一樣，枯草桿菌的表達機理也已被深入研究。但關于GIase在枯草桿菌中的表達還研究較少，HUANG［6］等把大腸桿菌的GI-ase基因和Bacillus licheniformis青霉素酶的啟動子相融合，使 GIase 基因在 B.subtilis成功表達，Lee［7］等將來源于Clostridium thermosulfurogenes的GIase基因克隆到大腸桿菌和枯草桿菌的穿梭質粒pMG1，其表達量為1.54 U/mg，高于該酶在野生菌的表達量0.29 U/mg。雖然枯草桿菌具有強大的蛋白分泌能力，但可能是因為GIase是胞內酶，兩位研究者測定的都是胞內酶活。在本實驗研究中我們嘗試選用不同誘導方式的枯草桿菌表達系統在胞內表達Thermobifida fusca GIase，并進一步研究培養基、溫度和pH等條件對重組枯草桿菌發酵產酶的影響。

1 材料與方法

1.1 菌種和質粒

Thermobifida fusca WSH03-11菌株，克隆宿主菌:E.coli JM109，B.subtilis WB600(his-nprB-nprE18-aprE-epr-bpf-mpr)，表達質粒 pHCMC04、pAL12 和pMA09均為本實驗室保藏。pMD18-T simple購自大連寶生物工程公司。

1.2 試劑

營養瓊脂、蛋白胨、酵母抽提物購自Oxoid，工具酶、基因組DNA提取試劑盒、PCR擴增試劑盒、DNA膠回收試劑盒均購自上海生工生物工程有限公司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。其他試劑均為國產分析純。

1.3 培養基

LB培養基，Amp終濃度100 μg/mL。TB:甘油5 g/L，蛋白胨12 g/L，酵母粉24 g/L，K2HPO416.4 g/L，KH2PO42.3 g/L。

1.4 重組質粒pHGI、pMGI和pAGI的構建

提取Thermobifida fusca的基因組DNA，并以此為模板PCR擴增GIase酶基因。PCR反應條件:94℃8 min;94℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃ 130 s，循環30次;72℃ 10 min。PCR引物如下:

PH1(5’-3’):A/CTAGTATGAGCAACTACCAGCCCACACCCG

PH2(5’-3’):G/GATCCTTAGCGCACGCCCAGGAGGTAGT

PM1(5’-3’):CATATGAGCAACTACCAGCCCACACCCGAG

PM2(5’-3’):G/GATCCTTAGCGCACGCCCAGGAGGTAGT

PA1(5’-3’):G/GATCCATGAGCAACTACCAGCCCACACCCG

PA2(5’-3’):T/CTAGATTAGCGCACGCCCAGGAGGTAGT

引物對PH1、PH2分別含SpeI和BamH I的限制性酶切位點(載體不含信號肽序列)，引物對 PM1、PM2分別含NdeI和BamH I的限制性酶切位點(去除信號肽序列 SestA)。引物對 PA1、PA2分別含BamH I和XbaI的限制性酶切位點(去除信號肽序列SamyQ)，分別以引物對擴增得到xylA基因片段，將其克隆、純化、回收后分別插入E coli-B.subtilis穿梭載體 pHCMC04［8］、pMA09［9］和 pAL12［10］中，其中，pHCMC04的啟動子為PxylA，為木糖或IPTG誘導表達;pMA09的啟動子為PHpaII，為組成性表達;pAL12啟動子為Pdes，為低溫25℃誘導表達。分別構建的重組質粒命名為pHGI、pMGI和pAGI。

1.5 枯草桿菌轉化及培養

枯草桿菌轉化參照Spizizen的方法［14］。挑取轉入表達宿主B.subtilis的單克隆于LB培養基生長9 h，按體積分數為1%的接種量將種子發酵液接入50 mL發酵培養基，在37℃搖床培養30 h，其中重組菌WB600/pHGI在培養到 OD600值為 1.5時，添加 4 mmol/L的IPTG誘導表達，WB600/pAGI在培養到OD600值為1.5時，降溫到25℃誘導表達，因WB600/pMGI為組成性表達，所以培養條件不作變動。每隔一段時間取樣，將發酵液于12 000 r/min離心2 min，除上清液收集菌體，將菌體復溶后超聲破壁12 000 r/min，4℃離心10 min，保留上清液、懸浮沉淀待用。

1.6 分析方法

DNA瓊脂糖凝膠電泳和表達產物的SDS-PAGE按文獻［11］方法進行。GIase活性的測定其異構轉化葡萄糖為果糖的活性。反應體系為1 mL，包含5 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)，900 mmol/L D-葡萄糖水溶液，5 mmol/L MgSO4水溶液，0.1 mL適當稀釋的酶液。反應體系在70℃水浴10 min，然后用1 mL 0.5mol/L HClO4溶液終止反應。反應體系中的D-果糖通過半胱氨酸-咔唑方法測定［12］。1個酶活力單位(U)定義為:上述反應條件下，1 min內生成的1 μmol D-果糖。菌體的濃度采用分光光度法測定。實驗設置3個重復。

1.7 重組枯草桿菌外源蛋白表達條件優化

1.7.1 不同培養基對產酶的影響

采用6種培養基發酵產酶，25 h后測定OD600值和酶活。

1.7.2 培養溫度對產酶的影響

在最佳培養基中，分別采用25、30、37℃培養25 h后測定OD600值和酶活。

1.7.3 初始pH對產酶的影響

在最佳培養基和最適溫度條件下，調節初始pH分別為 5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，25 h 后測定OD600值和酶活。

2 結果

2.1 重組菌B.subtilis WB600/pHGI、WB600/pM GI和WB600/pAGI的構建與表達

以提取的T.fuscaWSH03-11的 xylA基因(與GenBank Accession No.CP000088序列一致)片段插入pMD18-T simple質粒中，分別采用相應的引物PCR擴增目的基因，純化回收目的基因后分別與同樣酶切純化回收的枯草芽孢桿菌表達載體pHCMC04、pMA09和pAL12連接，轉化大腸桿菌JM109，挑取陽性克隆，提質粒，雙酶切鑒定，顯示出2條明顯的條帶，條帶大小與預期相符，證明xylA基因已成功連接到E.coli-B.subtilis穿梭載體pHCMC04、pMA09和pAL12中，將重組質粒分別命名為pHGI、pMGI和pAGI。將重組質粒分別轉化枯草芽孢桿菌WB600，獲得重組枯草芽孢桿菌WB600/pHGI、WB600/pMGI和WB600/pAGI。通過質粒提取和限制性酶切鑒定確認了重組菌構建成功。同時，以空載轉化宿主菌WB600為對照，處理方式同上。將上述重組枯草芽孢桿菌 WB600/pHGI、WB600/pMGI和 WB600/pAGI以及含空載質粒的枯草芽孢桿菌WB600/pHCMC04、WB600/pMA09和WB600/pAL12分別接入LB培養基中表達，間隔一定時間取樣，測定胞內GIase的酶活。測得重組枯草芽孢桿菌WB600/pHGI、WB600/pMGI和 WB600/pAGI破壁上清液的活力分別為1.1，1.8和1.3 U/mL，而含空載的重組枯草芽孢桿菌對照菌株均檢測不到GIase活性。利用質量分數為12%的SDS-PAGE對重組枯草桿菌破壁上清和破壁后沉淀進行檢測，在破壁上清和破壁沉淀中均發現與GI酶分子量相對應的約42 kDa處有條帶(圖1)。實驗結果一方面表明構建的3種重組質粒在重組枯草芽孢桿菌胞內均成功表達，且WB600/pMGI的表達量最高;另一方面表明重組枯草芽孢桿菌產酶速度過快，導致細胞破壁沉淀中也含有目的蛋白條帶，發酵過程有待近一步優化。

圖1 GIASE表達的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of the expression of GIase

2.3 重組枯草桿菌外源蛋白表達條件優化

選取上述實驗中表達量最高的重組菌株WB600(pMGI)對其表達條件進行進一步優化，因該載體為本底水平表達，對其搖瓶發酵的培養基、溫度和初始pH進行優化，并考察最優條件下搖瓶中重組B.subtilis WB600(pMGI)產GIase的發酵過程。

2.3.1 初始培養基對產酶的影響

首先選擇適合重組枯草桿菌表達GIase的培養基，將重組菌株置于6種較典型的枯草桿菌培養基中進行培養，測定 OD600值和酶活，其他條件為:初始pH 7.5，發酵溫度37℃，發酵時間25 h。在這些培養基中，TB培養基是最利于GIase表達的發酵培養基，發酵液中菌體的濃度最高，酶活力也最高，這可能與其pH緩沖能力強，營養成分豐富有關。如圖2，在TB培養基中，發酵25h后胞內酶活達到3.4 U/mL。

2.3.2 培養溫度對產酶的影響

表1為不同溫度下，菌體生長和產酶情況。其他條件為，TB培養基、初始pH 7.5和發酵時間25 h。結果表明:在30℃下酶活最高，為最適發酵溫度。

圖2 出發培養基對菌體生長和產GIase酶活力的比較Fig.2 Effect of media on cell growth and production of GIase

表1 溫度對GIase發酵生產的影響Table 1 Effect of temperature on the production of GIase

2.3.3 初始pH對產酶的影響

表2為不同初始pH對產酶的影響。其他條件為，TB培養基、發酵溫度30℃和發酵時間25 h。結果表明:控制初始pH在6.0～7.5有利于菌株產酶，初始pH在7.0時更有利于菌體生長，在pH 7.0時酶活最高，說明中性環境有利于該菌體的生長和外源基因的表達。

表2 初始pH對GIase發酵生產的影響Table 2 Effect of initial pH on the production of GIase

2.3.4 搖瓶中重組B.subtilis WB600(pMGI)產GI-ase的發酵過程

實驗進一步考察了搖瓶中重組B.subtilis WB600(pMGI)產GIase的發酵過程的菌體生長曲線和產酶曲線，以確定發酵終止時間。由圖3可知，重組菌約在20 h菌體濃度達到最高，產酶量約在24 h達到最高，所以合適的發酵終止時間為24 h。

圖3 搖瓶條件下重組B.subtilis WB600/pMGI產GIase的發酵過程Fig.3 Recombinant-GIase production by B.subtilis WB600/pMGI in shake flask

3 討論

本實驗室前期已將GIase在大腸桿菌中成功表達，但是為了更好滿足食品工業的安全要求，從國際公認的食品工業安全宿主菌(GRAS)著眼，選擇枯草桿菌這種工業上常用的工程菌嘗試表達GIase酶。研究首先將GIase基因分別克隆到表達載體pHCMC04、pMA09 和 pAL12 上，轉化B.subtilis TEB1030［13］、B.subtilis WB600 和 B subtilis WB800N(npr Eapr EeprbprmprblenprB::bsr.vprwprA:hyg cm:neo;NeoR)，僅B.subtilis WB600所獲得的基因工程重組菌能產GIase，而其他兩個宿主菌均不能表達目的酶，相對于 WB600敲除 6個酶基因，TEB1030敲除4個酶基因，WB800N敲除8個酶基因，可能WB600的表達系統更適合GIase的表達。而從GIase的產酶效率上看，pMA09＞pAL12＞pHCMC04。最后選擇組成型表達菌株WB600/pMGI進一步發酵優化，將該菌以TB為培養基，初始pH 7.0，30℃恒溫培養24 h后，測得發酵上清液酶活5.6 U/mL，為培養野生菌 Thermobifida fusca產 GIase酶量的12.3倍，是已知外源GIase在枯草桿菌最高表達量的3.5倍。本研究為探索GIase在枯草桿菌中的表達和生產提供了重要的參考。

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