mTOR信號通路在生精細胞發育中的作用

夏 靜 牛長敏 馬海濤 申雪沂 王建軍 綜述 鄭 英 審校

揚州大學醫學院 組織學與胚胎學教研室（江蘇揚州 225001）

mTOR信號通路在生精細胞發育中的作用

夏 靜 牛長敏 馬海濤 申雪沂 王建軍 綜述 鄭 英 審校

揚州大學醫學院 組織學與胚胎學教研室（江蘇揚州 225001）

精子發生是指精原細胞經過一系列分裂分化演變為精子的過程,包括精原干細胞的增殖及其子細胞分化、精母細胞的減數分裂和精子形成三個階段。許多研究表明mTOR信號通路參與精子發生的各個階段。本文主要就mTOR信號通路在生精細胞發育的不同階段中的作用做一綜述。

一、mTOR信號通路

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）廣泛存在于各種生物細胞中，是細胞生長的中心調控因子[1]。它存在兩個功能不同的復合物，mTORC1和mTORC2。其中mTORC1起主要作用，mTORC1包含mTOR、調節蛋白Raptor和其他結合蛋白，是抑制劑雷帕霉素的主要作用靶點，主要參與調節細胞生長、增殖和蛋白質合成。mTOR主要受磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT/PKB）信號通路的調節。mTOR通過對其下游翻譯相關蛋白：核糖體40s小亞基S6蛋白激酶（70-ku ribosomal protein S6 kinase，p70S6K）、真核細胞翻譯啟動因子4E結合蛋白1（eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein，4E-BP1）、真核細胞翻譯啟動因子4B（eukaryotic translation initiation factor 4B，eIF-4B）以及核糖體蛋白S6（ribosomal protein S6，rPS6）的磷酸化而發揮調控作用。其中4E-BP1是翻譯的負調控子，它與基因mRNA 5’端帽狀結合蛋白eIF-4E結合并抑制其活性，阻止翻譯起始。當上游某一信號刺激后，使mTOR磷酸化，磷酸化的mTOR使4E-BP1失活，導致4E-BP1與eIF-4E解離，游離的eIF-4E與eIF-4G、eIF-4B、eIF-4A結合形成eIF-4F起始復合物，結合到mRNA 5’末端的帽結構上，促進翻譯起始[2]。因此，mTOR活化的目的是使翻譯起始復合物形成，從而調控依賴性靶向mRNA的翻譯。

二、mTOR信號通路與精原細胞發育

精子發生始于SSCs，SSCs一部分自我更新（維持干細胞池），另一部分則分裂分化為Aal型精原細胞，Aal型精原細胞再分化為A1-A4、In及B型精原細胞。B型精原細胞演變成初級精母細胞，而mTOR可以通過多種信號通路來調控其增殖分化中相關基因的表達。

（一）mTOR在精原干細胞增殖中的作用

精原干細胞來源于原始生殖細胞，其依賴受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase, c-Kit）與干細胞因子（stem cell factor, SCF）相互作用而遷移至未分化性腺，啟動其增殖分化。研究發現雄鼠突變體由于SCF/c-kit不能激活PI3K通路而導致精子發生缺陷，表現出精原干細胞增殖能力減弱及細胞異常凋亡[3]。Feng等證實了SCF/c-KIT通過PI3K/AKT/mTOR信號的活化使細胞周期蛋白D3表達上調，促進G1 期到S 期，從而加速細胞周期[4]。而這條通路對G1期的細胞周期調節蛋白D1、CDK4、CDC25A 的合成均有抑制作用[4]。Busada等發現RA可通過PI3K/AKT/m TOR信號通路誘導精原細胞內c-Kit蛋白的合成[5]。推測：在精子發生中，PI3K/AKT/m TOR信號通路可能與c-kit存在反饋調節。mTOR通過磷酸化激活下游信號分子p70S6K，促進精原干細胞增殖分化中蛋白質的合成，隨著年齡的增長，mTOR蛋白表達下降且其對下游靶蛋白p70S6K的磷酸化能力下降，導致精子數量減少、生精小管空泡化增多[6]。以上研究表明，c-Kit與PI3K/ AKT/mTOR信號通路對有絲分裂增殖的調控是必不可少的。Huang等發現在大鼠睪丸內，胰島素樣生長因子受體1（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF -1R）-PI3K/AKT/mTOR/缺氧誘導因子2α（hypoxia inducible factor 2α，HIF-2α）信號通路調控著精原干細胞的增殖[7]。在培養的原始生殖細胞中，干擾IGF-1R表達或用PI3K抑制劑LY294002或雷帕霉素處理，均可有效抑制IGF-1R或八聚體結合轉錄因子4（octamer-binding transcription factor 4, Oct-4）與HIF-2α的表達，使原始生殖細胞數量明顯減少[7]。Hobbs等發現在敲除早幼粒細胞白血病鋅指蛋白（promyelocytic leukemia zinc fnger, PLZF）的大鼠精原干細胞模型中，過度活化的mTORC1可抑制精原干細胞對膠質細胞源性神經營養因子（glial-derived neurotrophic factor，GDNF）的反應并導致精原干細胞池中各型精原細胞數量顯著減少[8]。GDNF是精原干細胞增殖的關鍵因子，其調控SSCs自我更新和分化平衡[9]。另外，PLZF可通過誘導mTORC1抑制劑活化來抑制發育及DNA損傷反應調節基因1（regulated in development and DNA damageresponses 1, redd1）的表達[8]。

綜上所述， PI3K/AKT/m TOR與多種信號分子共同調控精原干細胞增殖分化，使其有序正常進行。

（二）mTOR在精原細胞分化中的作用

從Aal型精原細胞依次分化形成 A1、A2、A3、A4、In、B型精原細胞，其過程即A型精原細胞分化，而mTORC1的活性對分化相關基因的翻譯是必須的。

Busada等研究用雷帕霉素檢測了mTORC1對小鼠精原細胞分化的影響，發現mTORC1活化對未分化精原細胞的維持是非必需的，而對精原細胞分化的啟動是必不可少的[10]。眾所周知，RA對精原細胞分化起著重要調控作用，其中一條通路即是RA與其受體RARA結合作用于RAREs反應元件上，再結合到PI3K的調節亞基p85或催化亞基p110β后誘導ERK（細胞外信號調節激酶）及AKT的磷酸化，而mTOR有AKT磷酸化位點（Trh2446及Ser2448），使mTOR也被磷酸化，發揮激活下游蛋白功能[11]。在成年睪丸中雷帕霉素能使Stra8的表達降低，它是RA的一個直接調控靶基因，參與精原細胞分化[12]。同樣雷帕霉素也阻礙了分化相關基因Rhox13、Kit、Sohlh1、Sohlh2等mRNA的翻譯[10]。Rhox13（X-linked reproductive homeobox gene 13）是一個生殖同源框基因，在分化的精原細胞內它應答RA后表達上調，它的敲除將導致第一批生精波中生殖細胞凋亡、圓形精子出現的時間延遲[13]。精子發生與卵子發生特異性螺旋繞螺因子1（spermatogenesis and oogenesis specific basic helix-loop-helix 1, Sohlh1）、Sohlh2在分化的精原細胞中表達明顯增加，且Sohlh1、Sohlh2可以形成異二聚體，結合在Sohlh1基因上游的啟動子序列SP1上，啟動精原細胞分化，而兩者均可促進Kit在精原細胞中表達[14]。出生7 d 小鼠睪丸內Sohlh1 功能缺失會導致一系列基因表達變化，如在精原細胞分裂過程中起重要作用的 LIM同源基因 Lhx8 的表達降低，同時與精原細胞分化相關的一些基因如Kit、Ngn3和Crabp1的表達也會減少；Sohlh1 功能缺失的同時，睪丸也會表達一些特有的轉錄因子，如 Etv5、ERM、Taf-4b 和 PLZF，這些基因對精原細胞的增殖和分化有著重要的作用[15]。以上研究說明mTORC1信號通路的活化與否可以直接或間接影響分化相關基因的表達。另有研究發現RA也可通過與支持細胞表面受體KITL結合后激活PI3K/AKT/mTOR信號通路，使分化基因Kit蛋白表達[5]。

綜上所述，精原細胞通過PI3K/AKT/mTORC1信號通路應答視黃酸進行分化時，是以轉錄活性形式及增加激酶信號雙重應答的。

三、 mTOR對減數分裂細胞及其子細胞的作用

SSC經過有絲分裂后分化為初級精母細胞，隨后進入減數分裂形成圓形精子細胞。研究發現：與圓形精子細胞相比，精母細胞表現出更高水平的蛋白合成，這是通過rPS6的磷酸化翻譯水平的增加來實現的，rPS6也是mTOR下游分子，翻譯的標記物；磷酸化的rPS6在圓形精子細胞中是顯著降低的[16]，說明精母細胞及圓形精子細胞中翻譯的比例與rPS6磷酸化水平都是不同的。然而，在精子發生的后期rPS6磷酸化水平升高，與實驗中檢測出低蛋白合成率和mTOR表達水平顯著下降的結果不一致，這可能是由于p90RSK對rPS6磷酸化的調控所致[17]。p70S6K是mTOR下游的靶蛋白，它通過磷酸化核糖體S6蛋白質調節具有5’TOP的mRNAs,繼而調節數百種生物因子的轉錄。有研究發現在敲除p70S6K基因的果蠅細胞中，細胞周期延長到正常的二倍，這說明p70S6K在細胞周期進程中也有它的生理作用[18]。而在初級精母細胞中p70S6K有明顯表達，但胞核的著色明顯深于胞漿，而在精子中則無此趨勢[16]。精子形成以后精核高度濃縮，其轉錄與合成代謝水平低，精子合成p70S6K的可能性不大，這說明在生精過程中，p70S6K可能從胞核轉移到胞漿。而在晚期精子變形階段， rpS6磷酸化可能與mTOR的表達是解偶聯的。這也與此期EIF4F復合物裝配活性降低是一致的，這種復合物的形成通常是翻譯調控中受限的一步[19]。與粗線期精母細胞相比，EIF4G 在精子細胞中明顯上調，使得EIF4E與更多的 EIF4G 相互作用，從而抑制翻譯。以EIF4G 結合到5’帽端相互作用的（7-methyl-GTP）EIF4E 與它在細胞內水平的比例來檢測EIF4F裝配的有效性，發現精母細胞表現出更高的裝配有效性[19]。因為EIF4F裝配主要受mTOR活性的影響，且依賴于EIF4G 和EIF4EBP1對EIF4E的競爭，而mTOR（及其靶蛋白EIF4EBP1）的表達從精原細胞到長形精子是穩定下降[20]。研究發現雷帕霉素處理后，將抑制精母細胞中mTOR及p70S6K的活性，但不抑制磷酸化的4EBP1的活性[21]。這篇研究也發現，雷帕霉素會導致幾個精母細胞特異性miRNAs的表達發生改變，如：miR-15b, miR-18a, miR-34c,miR-425, miR-449a及miR-296-5p，尤其是使miR-15b, miR-18a, miR-425, miR-449a的表達水平顯著下調，而miR-375及 miR-34c 表達上調[20]。這些miRNA對其靶基因起著轉錄后的調控作用，如miR-15b的靶基因Akt3，是PI3K信號通路中的關鍵分子，它的改變將使這條通路調控異常。由此說明，在正常生理狀態下，mTOR也是受相關miRNA的調控，從而影響減數分裂中相關基因的表達。有關這方面的認識還需要進一步探索。另外有研究發現，用雷帕霉素處理抑制mTOR信號后，將會使細線前期精母細胞中的p-p70S6K、p-4EBP1、PCNA、Stra8的表達顯著下降，從而影響減數分裂[22]；同時，也發現mTOR、p-mTOR及p70S6K在生精小管不同階段的表達是不同的，在生精小管第Ⅶ-Ⅷ階段的細線前期精母細胞中，mTOR及p-mTOR顯著表達，p70S6K、p-p70S6K在細線期精母細胞中表達，而p-p70S6K在圓形精子細胞及管周肌樣細胞中也表達。以上研究表明，mTOR及其下游信號分子參與調控精母細胞減數分裂的過程。

Boyer等發現條件性敲除支持細胞內mTOR基因后，隨著精子發生的進程，成年小鼠睪丸表現出生精上皮的解體、支持細胞極性改變、生殖細胞凋亡增加、未成熟生殖細胞脫落、附睪內精子數量減少及畸形精子數量增加，從而造成不育[23]。組織學分析及階段特異性標記蛋白表達的定量分析發現，粗線期精母細胞及精子特異性丟失，而mTOR通過調節支持細胞內緊密連接蛋白α1的分布來影響粗線期精母細胞的進程[23]。

總之，mTOR信號通路的活性及與之相關的miRNA或相關基因的表達對減數分裂細胞及其子細胞的正常發育是必須的。

結語與展望

關于mTOR作為一種對細胞增殖分化關鍵因子，在精子發生的各個階段發揮著重要作用。其抑制劑雷帕霉素作為治療器官移植后的排斥反應在臨床上使用，關于其長期使用后影響男性生殖健康的原因和機制目前雖然有所認識，已有的結論與機制還不能完全詮釋它們在精子發生中的作用。因此，深入探究精子發生與mTOR信號通路之間的調控機制，將為男性生育能力的調控及生殖方面疾病的診斷和治療提供新的思路。

致謝：本文受國家自然科學基金（31371174）；揚州市社會發展科技攻關計劃（2012127）基金項目資助

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白; 生精細胞;信號通路; 精子發生

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（2016-07-04收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.10.017

R 321.1