精子發生相關的鋅指蛋白的研究

尤新國 樊姝彤 滿 怡 綜述 潘智芳 馮衛國 審校

濰坊醫學院細胞生物學教研室（山東濰坊 261053）

·綜 述·

精子發生相關的鋅指蛋白的研究

尤新國 樊姝彤 滿 怡 綜述 潘智芳 馮衛國 審校

濰坊醫學院細胞生物學教研室（山東濰坊 261053）

鋅指蛋白（zinc finger protein，ZNF）是一類廣泛存在于生物體內的具有“指狀”結構的轉錄因子，可以與DNA、RNA、鋅指蛋白等結合，完成各項生物學功能，如細胞的增殖凋亡、胚胎的發育、腫瘤的發生與抑制等。近年來研究發現，部分鋅指蛋白參與精子的發生，并在精子生成的過程中發揮重要的作用。本文對與精子發生相關的鋅指蛋白的背景知識及與精子發生的關系做簡單闡述。

一、鋅指蛋白的概述

（一）鋅指蛋白的結構及分類

1983年，Miller等首次在非洲爪蟾卵母細胞的轉錄因子TFⅢA中發現了呈“手指”狀的鋅指蛋白[1]。隨后，上千種鋅指蛋白被陸續發現。鋅指蛋白是目前所知真核生物基因組中分布最廣的蛋白。1989年，Lee等通過磁共振的方法證實，每個鋅指結構都是由2個反向平行的β折疊片和1個α螺旋組成的獨立的包含Zn2+的小結構域[2]，由組氨酸His和（或）多個半胱氨酸Cys通過Zn2+形成緊密的ββα四面體結構。Zn2+穩定了鋅指蛋白的螺旋構象，是鋅指蛋白發揮調控功能的關鍵。

根據鋅指蛋白保守結構域的特征，可以分為C2H2型、C4型、C6 型三類。其中 C4型又包括GATA蛋白，LIM蛋白和核激素受體蛋白[3]。

（二）鋅指蛋白的作用方式

鋅指蛋白具有可以識別DNA的結合域，是最大的 DNA 結合蛋白家族。通過自身的DNA結合域進入DNA雙螺旋反應溝內，與DNA 堿基發生特異性結合，識別特定的DNA 序列[4]。其次，某些鋅指蛋白也可以結合RNA。Searles等第一次詳細研究了TFⅢA中的鋅指與5s RNA結合的特性[5]。同時，Mackay證明，鋅指蛋白與鋅指蛋白之間，也能夠通過相互作用調控基因的轉錄水平，完成相應的生物學功能[6]。

二、鋅指蛋白與精子發生

精子發生是精原細胞經過分裂分化發育為精子的過程，包括生殖細胞發育為精原細胞，精原細胞增殖再發育為精母細胞，精母細胞減數分裂形成圓形精子，圓形精子變形為精子等階段。該過程涉及眾多基因和蛋白的調控[7,8]。

（一）鋅指蛋白313

ZNF313基因定位于20q13，編碼288個氨基酸，屬于C2H2類鋅指蛋白[9]。ZNF313基因具有2個轉錄本，較短的為753bp，較長的為24Kb，兩者開放閱讀框架完全一致。較短的轉錄本在睪丸組織中高表達[10]。RT-PCR分析顯示，與正常男性睪丸比較，ZNF313基因在無精子癥患者及胎兒睪丸中的表達明顯降低；通過免疫組化檢測及亞細胞定位發現，ZNF313定位于精原細胞、初級精母細胞和次級精母細胞的細胞核中。該基因主要是核蛋白，可能參與了睪丸組織的發育過程并調控精子發生，主要在精原細胞增殖，精母細胞減數分裂形成圓形精子的過程中發揮作用。

ZNF313同時含有C3HC4的RNIG鋅指結構域和C2H2的鋅指結構域[9]。生物信息學分析發現[11,12]：不同生物ZNF313的兩種鋅指結構域及其周圍的氨基酸序列均十分保守。預測這兩個結構域在ZNF313功能研究方面發揮重大作用。ZNF313的RING鋅指結構域有兩個β折疊片（β1和β2），一個α螺旋。C2H2鋅指結構區域有一個較長的α螺旋。這個區域與泛素結構域（UIM domain）有一定的同源性[11]。推測ZNF313蛋白對精子生成過程的調控是通過泛素途徑實現的。

Proscan軟件分析發現，ZNF313基因缺乏TATAbox和CAATbox啟動子序列，但檢測到 AP-2、T-Ag 和 SP-1結合位點等保守序列[13]。 轉錄因子特化蛋白-1（SP-1）結合于保守性序列GGGCGG的GC豐富序列，并發揮重要的轉錄調控作用[14]。研究發現，SP-1可在多種組織中表達，調節細胞生長及細胞周期調節蛋白的表達。深入探究SP-1在ZNF313基因的表達調控中所起的重要作用，將有助于分析ZNF313基因在生精過程中的具體作用，為無精子癥疾病的治療提供好的解決方案。

（二）鋅指蛋白265

ZNF265首先由Karginova等[15-17]在大鼠腎球旁細胞中克隆，具有兩個C4型鋅指蛋白，一個Ser-Are（SR）富集區，一個谷氨酸富集區，一個核定位信號（NLS）。ZNF265在組織中普遍表達，具有典型的RNA結合結構域，可以推測ZNF265通過與目的基因的mRNA結合調控目的基因，在基因調控，細胞分化，個體發育、疾病發生等方面發揮重要作用。

ZNF265在大鼠睪丸組織中的表達具有特異性，主要表達在睪丸支持細胞細胞核核周胞質，精子的尾部前端、血-睪屏障、血-附睪屏障。目前ZNF265與精子發生相關的實驗研究重點集中在其表達對睪丸支持細胞的免疫調節機制[18]。研究已證實，支持細胞通過分泌TGF-β1、表達FasL，抑制炎癥因子IL-lα和IL-6 的表達，發揮免疫調節作用[19]。干擾ZNF265表達后，IL-lα和 IL-6 的表達升高。而炎癥晚期高表達的ZNF265則下調了炎癥因子的表達，推斷ZNF265作為調控因子，可能通過作用于TGF-β1在支持細胞炎癥反應中發揮負調節作用。明確ZNF265在支持細胞中的調控機制，對于深入研究精子發生的調節等過程具有重要意義。

（三） 鋅指蛋白185

1997年，Heiss等[20]通過外顯子捕獲的方法獲得ZNF185。該基因定位于X 染色體長臂2區8帶（Xq28）DXS52 區域。ZNF185cDNA編碼一個452個氨基酸的蛋白，其鋅指結構中富含Cys，結構單體為Cys2HisCys5，C端有一個LIM（Lin-1,Isl-1 and Mc-e 3）結構域，是LIM型鋅指蛋白。LIM結構域和多種蛋白質，如蛋白激酶、轉錄調控因子等發生相互作用，調控某些基因的表達、細胞分化和細胞骨架形成等過程[21]。ZNF185在前列腺、骨髓、外周血、腦、肺、腎等組織也有較高表達[22]。

提取小鼠肝、睪丸與卵巢組織進行Westernbloting及免疫熒光技術分析發現，睪丸組織中ZNF185含量最多，在睪丸支持細胞、間質細胞和成熟精子中都有表達，成熟精子中表達量最高[23,24]，明確了ZNF185在生殖細胞中的定位。支持細胞的主要作用是為各級生精細胞提供結構支持，形成血-睪屏障，提供營養物質，調節精子發生等。間質細胞的主要作用是合成并分泌雄性激素（主要是睪酮），ZNF185在小鼠支持細胞和間質細胞的胞質高表達，推測ZNF185與精子發生過程中免疫屏障結構的形成及雄性激素的合成、分泌及運輸相關[25-28]。

前期研究發現，ZNF185在性成熟前小鼠睪丸中的表達低于性成熟組和老年組，在精原細胞和精母細胞中無表達，精子中高表達。提示ZNF185在精子發生過程中主要作用于精子形成及釋放過程。有研究報道表明，ZNF185參與了肌動蛋白（actin）共定位[29]。2012年鄭全輝等證明ZNF185 與細胞骨架的結合是其發揮抑癌作用的關鍵，ZNF185通過與肌動蛋白纖維的結合，抑制人膠質瘤細胞的遷移[30,31]。而精子發生包括有絲分裂期，減數分裂期和精子形成期，該過程涉及細胞的分裂，運動等生理過程，需要大量細胞骨架的參與。推測ZNF185和精子發生密切相關，其發生機制與細胞骨架相關。分析其表達調控機制可以豐富精子發生的分子機理，為避孕藥的研發提供可靠的分子靶點，具有重要的臨床意義。

三、結語

雖然人類輔助生殖技術發展迅速，但對于導致男性不育的關鍵基因及作用機制知之甚少。發現并確定這些基因的作用機制才能為臨床治療提供理論支持，從根本上解決問題。鋅指蛋白基因家族作為哺乳動物最大的基因家族之一，近年來在癌癥的發生，機體免疫系統的調控等方面具有重要的研究前景。隨著研究的進行，鋅指蛋白在精子發生過程中的作用日益受到重視。以上概述了與精子發生相關的部分鋅指蛋白的知識背景和研究進展，為研究生精過程的作用機制提供了部分理論依據。鋅指蛋白具有的生物學功能是廣泛多樣的，如ZNF185不僅影響精子發生，同時在腫瘤發生和細胞骨架方面也起了至關重要的作用等。這啟發我們，研究鋅指蛋白和精子發生的作用機制，可以通過這些蛋白在其他領域的生物功能，進行推測分析。

近年來，隨著對鋅指蛋白作用方式的分析研究，根據人類需要，設計相應功能的人工鋅指蛋白調控目的基因等技術有了很大發展，因此對鋅指蛋白功能的研究尤為重要。目前所了解的鋅指蛋白在精子發生方面的研究尚處于起步階段，其具體的生殖調控機制尚待探討和完善。相信隨著進一步的研究，更多與精子發生相關的鋅指蛋白被發現?？梢源_定，鋅指蛋白的研究與應用，在精子發生方面有重大的前景，對男性不育等問題具有重要的理論和臨床意義。

致謝：本課題受山東省科技發展計劃（2 0 1 5 G S F 1 1 8 1 7 8）；山東省自然科學基金（ZR2013CM032）；山東省衛計委科技項目（201411）；濰坊醫學院科技創新基金（K1302001）資助

鋅指蛋白; 精子發生; 基因

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（2016-08-30收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.10.016

R 321.1; R 349.64