內質網應激在順鉑誘導離體小鼠耳蝸毛細胞凋亡中的作用*

張曉　周明生　于利　王愛梅

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內質網應激在順鉑誘導離體小鼠耳蝸毛細胞凋亡中的作用*

張曉1周明生1于利1王愛梅1

【摘要】目的研究內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)在順鉑誘導離體培養小鼠耳蝸毛細胞凋亡中的作用。方法選取出生后 3 d的健康昆明小鼠380只(760耳)，分離出耳蝸基底膜760條，體外培養24 h后，隨機分為對照組和4、8、16 μg/ml順鉑組，每組190條，對照組加入2 ml新鮮培養基，順鉑組分別加入2 ml含不同濃度順鉑(4、8、16 μg/ml)的新鮮培養基，再繼續培養24 h后，應用Hoechst 33258熒光染色觀察耳蝸毛細胞凋亡情況，并應用Western blot檢測ERS標志物葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)和內質網凋亡途徑標志物半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12(cysteinyl aspartate specific proteinase 12，caspase-12)在耳蝸毛細胞中的表達。 結果4、8、16 μg/ml順鉑組耳蝸毛細胞凋亡率分別為10.53%±0.50%、27.12%±2.64%和60.01%±2.75%，均高于對照組(3.67%±0.76%)，呈現明顯的量效關系；不同濃度順鉑組耳蝸GRP 78和caspase-12的蛋白表達水平亦較對照組明顯增高(P<0.01)，并隨順鉑濃度增大而顯著增強(P<0.01)。結論順鉑可誘發小鼠耳蝸毛細胞ERS，ERS可能在其誘導的小鼠耳蝸毛細胞凋亡中發揮了作用。

【關鍵詞】內質網應激；順鉑；耳蝸；凋亡；小鼠

網絡出版時間：2015-12-2815：12

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20151228.1512.010.html

*遼寧省自然科學基金資助項目(2014022029)

1遼寧醫學院生理學教研室(錦州121001)

順鉑是臨床上常用的高效化療藥物，具有很強的耳毒性，其機制與觸發耳蝸內氧自由基的過量生成并最終導致耳蝸毛細胞凋亡有關[1]。研究表明，在順鉑誘導耳蝸細胞凋亡的過程中有線粒體和死亡受體這兩條細胞凋亡途徑參與[2]；最近發現，內質網途徑是順鉑誘導細胞凋亡的一種新型途徑[3]。內質網是真核細胞中最重要的負責蛋白質合成與折疊的細胞器，其可受缺氧、藥物毒性、氧化應激等因素影響，導致其功能受損，從而產生內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[4]；在此過程中，ERS特異性標志蛋白葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)持續高表達，并最終激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12(cysteinyl aspartate specific proteinase 12，caspase-12)，觸發內質網凋亡途徑，導致細胞凋亡[5, 6]。ERS是否參與了順鉑誘導的小鼠耳蝸毛細胞凋亡，目前尚不清楚。據此，本研究擬通過觀察順鉑對離體培養小鼠耳蝸毛細胞的凋亡作用，并檢測順鉑干預的離體培養小鼠耳蝸中ERS特異性標志蛋白GRP78和caspase-12的表達，初步探討ERS在順鉑誘導離體小鼠耳蝸細胞凋亡中的作用，為臨床防護順鉑的耳毒性提供參考。

1材料與方法

1.1實驗材料實驗動物為生后3 d的健康昆明小鼠380只(760耳)，雌雄不限，由遼寧醫學院實驗動物中心提供；順鉑和牛血清白蛋白購自美國Sigma公司，DMEM/F12培養基購自美國Hyclone公司，Hoechst 33258購自上海碧云天生物技術研究所，羊抗GRP 78抗體購自美國Santa Cruz公司，兔抗caspase-12抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司；Mini-PROTEAN電泳儀由美國Bio-Rad公司生產，MCO-15A型CO2培養箱由日本SANYO公司生產，BX41研究級正置熒光顯微鏡由日本Olympus公司生產。

1.2實驗方法

1.2.1耳蝸基底膜培養將小鼠用75 %乙醇噴灑消毒，斷頭后沿矢狀縫剪開顱骨，除去腦組織，暴露出顱底。體視顯微鏡下取出小鼠耳蝸，移入預冷的Hanks液中，去除耳蝸殼，依次剝離螺旋韌帶、前庭膜以及血管紋等結構，分離出整個基底膜，共分離760條耳蝸基底膜。在培養皿中滴入10 μl膠原凝膠液，室溫下放置15～20 min。待膠原凝膠液凝固后，加入含1%牛血清白蛋白的DMEM/F12培養基1 ml，然后將分離的基底膜平鋪到凝膠表面，在37 ℃、5% CO2培養箱中孵育，4 h后再加入1 ml培養基，直至覆蓋凝膠。然后將培養皿放回培養箱中繼續培養24 h[7]。

1.2.2實驗分組及離體順鉑耳毒性模型制備經培養24 h后，棄去原培養基，將基底膜隨機分為對照組和4、8、16 μg/ml順鉑組，每組190條，對照組加入2 ml新鮮培養基，其余3組分別加入2 ml含有不同濃度順鉑(4 μg/ml、8 μg/ml和16 μg/ml)的新鮮培養基，繼續培養24 h后終止實驗。每組隨機取10條基底膜用于Hoechst 33258熒光染色，其余的每30條基底膜合為一份標本，每組共6份標本，用于進行Western blot以檢測GRP 78和caspase-12的表達。

1.2.3Hoechst 33258熒光染色及耳蝸凋亡毛細胞計數終止實驗后吸出培養基，用PBS漂洗基底膜，然后緩慢加入4 %多聚甲醛，4 ℃下固定過夜。次日，PBS漂洗后加入0.25 %Triton X-100溶液，室溫下處理30 min。PBS漂洗后加入Hoechst 33258溶液(2.5 μg/ml)室溫避光染色10 min。PBS漂洗后，將基底膜連同凝膠一起放在滴有抗熒光淬滅封片劑的載玻片上，蓋上蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察耳蝸毛細胞的凋亡情況，以細胞核呈高亮狀態、出現核固縮、核碎裂的毛細胞判定為凋亡毛細胞。在熒光顯微鏡下，將各組耳蝸基底膜由底端向頂端隨機選取200個毛細胞，計數其中凋亡的毛細胞個數，并根據公式：毛細胞凋亡率=凋亡毛細胞數/200×100%，計算出毛細胞凋亡百分率。

1.2.4Western blot檢測GRP78和caspase-12的表達向標本中加入RIPA裂解液，0 ℃下超聲粉碎30 s，然后4 ℃下離心25 min(12 000 rpm/min)。取上清并測定蛋白含量。灌膠后每條泳道加入40 μg蛋白樣品，經SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉膜，再置于10%牛血清白蛋白封閉液中，4 ℃下搖床孵育1 h。然后分別加入抗GRP78和caspase-12抗體(均為1:1 000稀釋)，4 ℃下搖床過夜。次日，TBST沖洗后加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1:1 000稀釋)，4 ℃下搖床孵育1 h。TBST沖洗后滴加ECL顯色劑，曝光、顯影后得到電泳條帶。應用Image-Pro Plus 6.0 軟件讀取各電泳條帶的灰度值，以β-actin作為內參照物，GRP78/β-actin和caspase-12/β-actin比值分別代表GRP78和caspase-12的蛋白表達水平。

1.3統計學方法應用SPSS 19.0統計軟件對實驗數據進行分析，各組間數據比較采用單因素方差分析及SNK檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義，P<0.01表示差異有顯著統計學意義。

2結果

2.1各組離體小鼠耳蝸毛細胞的凋亡比較Hoechst 33258熒光染色結果顯示，對照組小鼠耳蝸毛細胞核多呈淡藍色，核內染色質分布比較均勻(圖1a)，而順鉑組小鼠耳蝸毛細胞核多呈亮藍色，核內染色質邊緣化、凝集成塊狀或呈不規則碎片狀；并且隨著順鉑濃度的逐漸增大，破碎的細胞核顯著增多(圖1b~1d)。對照組耳蝸毛細胞凋亡率為3.67%±0.76%，而不同濃度順鉑組毛細胞凋亡率較對照組明顯增高(P<0.01)，并呈現出明顯的量效關系(表1)。

圖1　各組離體小鼠耳蝸毛細胞凋亡檢測　(Hoechst 33258熒光染色，bar=20 μm)

±s，n=10)

注：*與對照組比較，P<0.01；#與4 μg/ml順鉑組比較，P<0.01；▲與8 μg/ml順鉑組比較，P<0.01

2.2各組離體小鼠耳蝸毛細胞GRP 78和caspase-12的表達Western blot 檢測結果顯示，對照組小鼠耳蝸毛細胞ERS標志性蛋白GRP78和caspase-12的電泳條帶較弱，而不同濃度順鉑組GRP78和caspase-12的電泳條帶明顯深于對照組(圖2)。半定量分析結果顯示，不同濃度順鉑組GRP78/β-actin比值和caspase-12/β-actin比值均較對照組明顯增大(P<0.01)，即GRP78和caspase-12的蛋白表達水平均較對照組明顯增高(P<0.01)，并且隨著順鉑濃度的逐漸增高而顯著增強，呈現明顯的量效關系(P<0.05)(表2)。

圖2　各組離體小鼠耳蝸毛細胞GRP 78和caspase-12電泳條帶

A. 對照組；B. 4 μg/ml順鉑組；C. 8 μg/ml順鉑組；D. 16 μg/ml順鉑組

表2各組離體小鼠耳蝸毛細胞GRP 78和caspase-12

組別GRP78/β-actin比值caspase-12/β-actin比值對照組35.88±0.6516.65±0.084μg/ml順鉑組44.09±0.43*31.34±0.11*8μg/ml順鉑組64.40±0.85*#56.63±0.40*#16μg/ml順鉑組83.12±0.37*#▲60.01±0.51*#▲

注：*與對照組比較，P<0.01；#與4 μg/ml順鉑組比較，P<0.01；▲與8 μg/ml順鉑組比較，P<0.01

3討論

凋亡是細胞的一種基本生物學現象，是在多基因嚴格控制下的細胞主動爭取有序死亡的過程，以維持細胞的內環境穩態。然而，射線、藥物等多種因素都能誘導細胞凋亡的異常增多，從而引發疾病。研究表明，誘導耳蝸細胞凋亡是順鉑產生耳毒性損傷的重要機制之一[1, 2]，順鉑水解產物的主要靶點是DNA，導致DNA鏈內和鏈間發生交聯，形成加合物，從而使DNA的結構發生變形，細胞內某些蛋白可以識別DNA的這些變形損傷并與之相互作用，進而啟動了細胞凋亡途徑[8]。DNA特異性熒光染料Hoechest 33258可與細胞核DNA進行非嵌入式結合，使細胞核著色，在紫外光激發下呈現明顯的藍色熒光；本研究選用Hoechest 33258熒光染色觀察順鉑對離體新生小鼠耳蝸毛細胞的凋亡作用，結果顯示，對照組偶有毛細胞凋亡，而不同濃度順鉑組凋亡毛細胞則較對照組明顯增多，并且隨著順鉑濃度的逐漸增高，毛細胞凋亡率亦顯著升高，表明順鉑已誘導離體小鼠耳蝸毛細胞發生凋亡。

研究表明，順鉑誘導耳蝸細胞凋亡的途徑可分為內源性(線粒體)途徑與外源性(死亡受體)途徑，這兩條途徑最終都依賴于caspase的激活而引起細胞凋亡[2]。近年來發現，內質網途徑是順鉑誘導細胞凋亡的一種新型途徑[3]；內質網作為一個重要的細胞器，主要參與內分泌蛋白和膜蛋白的翻譯、合成、折疊及修飾等過程；當藥物、毒素、氧自由基等多種生理或病理刺激導致蛋白質在細胞內沒有正確折疊時，則大量的錯誤折疊/未折疊蛋白在內質網腔內堆積，從而擾亂內質網的正常功能，產生ERS，這時，ERS主要通過啟動未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)以達到緩解應激、保護細胞的作用。然而，ERS持續存在時，UPR將不能修復細胞損傷，最終激活內質網凋亡途徑誘導細胞凋亡。GRP 78作為第一個被發現的內質網分子伴侶，既參與UPR的調控，也參與ERS的啟動和細胞凋亡的發生，因此，GRP 78的高表達已成為細胞ERS存在的標志[9]。Caspase-12是caspase家族中唯一定位于內質網的成員，僅特異性地在ERS介導的凋亡途徑中被活化，而在線粒體或死亡受體介導的凋亡途徑中則不被活化，故caspase-12是ERS介導細胞凋亡的標志分子。謝靜等[10]觀察到老年大鼠耳蝸中caspase-12水平顯著升高，提示內質網特異性凋亡途徑參與了老年性聾的發生和發展；此外，該實驗在用D-半乳糖制備的衰老模型大鼠耳蝸細胞中觀察到GRP 78的高表達，提示擬老化大鼠模型中內耳代謝紊亂誘導了ERS反應，GRP 78參與了內耳損傷的過程[11]。薛秋紅等[12]報道強噪聲可誘導豚鼠耳蝸螺旋神經節細胞凋亡，同時伴隨GRP 78和caspase-12的高表達，提示ERS參與了強噪聲誘導的豚鼠耳蝸細胞凋亡。本研究結果顯示，給予不同濃度順鉑后，離體新生小鼠耳蝸毛細胞凋亡率明顯升高，同時GRP 78和caspase-12的蛋白表達水平也明顯增強，與對照組比較有顯著性差異；并且隨著順鉑濃度的逐漸增大，毛細胞凋亡率及GRP 78和caspase-12的蛋白表達水平亦顯著增高，呈現明顯的量效關系。由此提示順鉑可誘發小鼠耳蝸毛細胞ERS，ERS參與了順鉑誘導的小鼠耳蝸毛細胞凋亡。至于ERS發揮作用的具體機制及其相關分子通路，尚有待今后進一步深入探討。

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(2015-01-01收稿)

(本文編輯李翠娥)

·實驗研究·

The Role of Endoplasmic Reticulum Stress in Cisplatin-Induced Apoptosis

of Mouse Cochlear Hair Cell in Vitro

Zhang Xiao, Zhou Mingsheng, Yu Li, Wang Aimei

(Department of Physiology, Liaoning Medical University, Jinzhou, 121001, China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the role of endoplasmic reticulum stress (ERS) in cisplatin-induced apoptosis in mouse cochlear hair cells in vitro.MethodsA total of 760 cochlear basilar membranes from healthy Kunming mice at postnatal day 3 were isolated and cultured for 24 hours, then randomly divided into the control group and the cisplatin groups (4 μg/ml, 8 μg/ml and 16 μg/ ml) , each group contained 190 basilar membranes. Four groups were continually cultured for another 24 hours. Cochlear hair cell apoptosis was determined by Hoechst 33258 staining. The protein expressions of glucose-regulated protein 78 (GRP78, a marker of ERS) and cysteinyl aspartate specific proteinase 12 (caspase-12, a marker of apoptosis) were determined by Western blot.ResultsThe percent of apoptotic hair cells in the 3 cisplatin groups (10.53%±0.50%，27.12%±2.64% and 60.01%±2.75%, respectively) was greater than that of in the control group (3.67%±0.76%), showing a clear dose-response relationship (P<0.01). Furthermore, cisplatin dose-dependently increased the expression levels of GRP 78 and caspase-12 (all P<0.01, vs. control). ConclusionOur results suggest that cisplatin induces ERS in the mouse coch hair cells, which may play a role in the cisplatin-induced cochlear hair cell apoptosis.

【Key words】Endoplasmic reticulum stress；Cisplatin；Cochlea；Apoptosis；Mouse

通訊作者：王愛梅(Email: aimeiwang88@163.com)

作者簡介：張曉，女，河北人，碩士研究生，主要研究方向為聽覺生理與病理。

【中圖分類號】R764.43

【文獻標識碼】A

【文章編號】1006-7299(2016)01-0054-04

DOI：10.3969/j.issn.1006-7299.2016.01.013