火炬松生長和松脂性狀相關候選基因的單核苷酸多樣性分析

楊會肖， 劉天頤， 徐　斌， 劉純鑫， 王金榜， 黃少偉

(1 廣東省林業科學研究院， 廣東 廣州 510520； 2 廣東省森林植物種質創新與利用重點實驗室/華南農業大學 林學與風景園林學院， 廣東 廣州 510642； 3 英德市林業科學研究所， 廣東 英德 513000)

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火炬松生長和松脂性狀相關候選基因的單核苷酸多樣性分析

楊會肖1，2， 劉天頤2， 徐斌1， 劉純鑫2， 王金榜3， 黃少偉2

(1 廣東省林業科學研究院， 廣東 廣州 510520； 2 廣東省森林植物種質創新與利用重點實驗室/華南農業大學 林學與風景園林學院， 廣東 廣州 510642； 3 英德市林業科學研究所， 廣東 英德 513000)

摘要：【目的】對火炬松Pinustaeda生長和松脂產量相關功能基因單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphism，SNP)位點進行篩選與分析，為分子標記輔助育種提供技術基礎?！痉椒ā坷蒙镄畔W對火炬松cDNA文庫進行整理、比對、剪接、注釋，挑選出與生長素、赤霉素、細胞分裂素及蒎烯合成相關的非重復序列基因(Unigene)作為候選基因片段，利用MEGA5.0和DnaSP4.0軟件對火炬松36個單株的8個候選基因片段進行序列比對和分析?！窘Y果】 所測序列總長為5 177 bp，檢測到184個SNP位點，平均36.9 bp的基因序列中出現1個SNP位點，其中123個為非同義突變、61個為同義突變SNP位點。核苷酸多態性πa和θw分別為0.020和0.016。對8個候選基因片段內SNP位點進行的連鎖不平衡分析顯示，隨著核苷酸序列長度的延伸，SNP位點的連鎖不平衡在基因內部迅速衰退(R2≤0.2)?！窘Y論】在火炬松中，基于候選基因內SNP位點間的連鎖不平衡作圖是可行的。

關鍵詞：火炬松； 候選基因； 單核苷酸多態性； 連鎖不平衡

林木的重要性狀大多屬于數量性狀，由許多基因和環境共同作用來調控其生長與發育。傳統的數量遺傳學不能檢測控制數量性狀的基因的數量、基因在染色體上的位置、每個位點的貢獻大小以及基因間的關系。在數量性狀的多基因體系中，盡管可能存在效應較大的主效基因，但多數基因對目標性狀可能只表現微效作用，而且表型受環境影響很大，因而采用傳統的育種途徑對這些性狀進行選擇有很大的局限性[1-2]。近年來，連鎖分析和連鎖不平衡作圖已成為許多樹種檢測復雜性狀的手段。關聯分析是對控制數量性狀的多基因系統進行遺傳剖析的有效手段，而關聯作圖則是植物遺傳學研究最重要的工具之一[3]。對某一植物種而言，篩選出的單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphism，SNP)位點在進行關聯分析之前，有必要對目標基因的群體遺傳學特征如核苷酸多樣性、基因進化動力及連鎖不平衡特征進行分析，以便為SNP基因型分析位點的確定提供參考[4]。

火炬松Pinustaeda材性偏軟，具有粗糙的質感，適用于船舶樓宇及一般建筑。生長素(IAA)、細胞分裂素與赤霉素在樹木生長過程中起到重要的調節作用?；鹁嫠珊休^豐富的松脂，可為制藥和化工等行業提供原料。當松樹受到甲蟲危害時，能在傷口處產生組成型或誘導型的松脂[5]，松脂是一種復雜的混合物，它包含單萜烯(松節油)，二萜類樹脂酸(松香)和較少量的倍半萜烯，而松節油的主要成分為蒎烯[6]。目前，關于松樹SNP標記的研究較多，主要集中在生長[7]、材性[8-9]、代謝[10]、抗旱抗性[4,11]等方面，鮮見火炬松激素和蒎烯相關候選基因SNP標記研究的報道。本研究以生長和松脂產量為目標，從引自美國的火炬松基因資源試驗林中選出36個單株為材料，并選擇8個相應的候選基因片段進行研究。通過PCR擴增、純化回收后連接于T載體上，對目的片段的SNP位點進行了篩選，分析了目標基因核苷酸多樣性，連鎖不平衡特征。研究結果為后續SNP標記與表型性狀的關聯分析提供參考。

1材料與方法

1.1植物材料

通過美國北卡羅萊納州立大學林木改良工業協作組織引進的258個不同改良程度的火炬松家系，營造了基因資源林，以生長(樹高和胸徑)和松脂產量為目標性狀，利用ASReml軟件估算了258個家系的生長和松脂產量育種值，選取能夠最大程度地反映基因資源變異水平的36個家系，每家系1株，共36個單株(36個基因型)，采集嫩芽或1年生新鮮松針，-80 ℃冰箱中保存備用。

1.2基因組DNA提取

取出保存的松針或嫩芽，稱取0.3 g，放入2 mL離心管中，加入小鋼珠，利用Qiagen的MM301磨樣儀將其磨碎，期間用液氮浸泡數次?；蚪MDNA的提取按照新型植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)描述的方法進行。

1.3引物設計和PCR擴增

從公共數據庫(GenBank和http://pinetree.ccgb.umn.edu)下載火炬松cDNA文庫的所有記錄，約32萬條，利用生物信息學方法進行序列的比對、剪接、組裝、注釋，獲得非重復序列基因(Unigene)。選取與生長、松脂蒎烯合成相關的8個候選基因片段，采用Primer6和Oligo7軟件設計和評估正反向PCR擴增引物[12]。

以選取的36個單株樣本為材料，對8個候選基因片段進行PCR擴增。PCR反應體系為25 μL，含30～60 ng模板DNA，每種dNTP 0.2 mmol·L-1，正、反向引物各0.2 mmol·L-1，1×PCR Buffer，1 UTaq聚合酶和體積分數為1%的DMSO。采用PTC-200型PCR儀運行PCR反應，反應程序為：94 ℃預變性5 min后進入循環；每個循環94 ℃變性30 s，45～62 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s,反應共36個循環；72 ℃延伸7 min。

1.4PCR產物的克隆、測序及計算機分析

依據所選的8個候選基因片段的核苷酸序列設計基因特異的引物，以36個樣本的總DNA為模板進行PCR擴增，將擴增得到的目的基因片段純化回收后連接于pMD19-T載體上。連接產物轉化大腸埃希菌EscherichiacoliDH5α，篩選陽性克隆，送華大基因公司測序。應用DNAMAN 6.0軟件和CLUSTALX軟件包推導出氨基酸序列并在NCBI進行檢索分析，初步判斷候選序列位于編碼區還是非編碼區。將去除載體后的序列采用BioEdit的ClustalW2程序進行聯配分析，獲得基因片段的一致序列，結合每條序列測序圖，在BioEdit中確定SNP位點并做記錄。

1.5基因的SNP多樣性分析和連鎖不平衡檢測

利用MEGA5.0和DnaSP4.0軟件對每個基因的36個序列進行比對分析，計算SNP頻率、顛換和轉換的SNP數量，估算各基因的核苷酸多樣性水平[13]。分別用參數θw和πa表示核苷酸多樣性水平，其中θw的估算以序列間每位點差異核苷酸的平均數為基礎[14]，πa的估算以分離位點的數量(S)為基礎[15]。單倍型多樣性(He)按照Nei[14]的公式計算。除以上定義外，核苷酸多樣性的描述還包括：靜默位點多樣性(θwsil)、非同義突變多樣性(πnsyn)和同義突變多樣性(πsyn)。將所有位點依次對應的物理距離(bp)及其R2進行組合，利用非線性回歸模型估算8個候選基因片段整體水平上的連鎖不平衡(LD)延伸。

2結果與分析

2.1候選基因片段的序列分析

8個候選基因片段序列分析結果見表1。每一候選基因片段的擴增長度為431～1 007 bp(不包括插入或缺失位點)，8個候選基因片段的測序總長度為5 177 bp，其中，編碼區的序列長度為3 322 bp，非編碼區的序列長度為1 855 bp(5′-UTR，3′-UTR 和內含子)。共有24個樣本發生插入或缺失突變，總的插入片段長度為18 bp，缺失片段長度為80 bp。

表1　火炬松生長和松脂性狀候選基因片段序列分析

2.2SNP位點篩選

SNP位點篩選和分析結果見表2，對8個候選基因片段的序列進行整合后共檢測到184個SNP位點，平均36.9 bp的基因序列中出現1個SNP位點。SSGP_VOLCA基因片段上檢測了41個SNP位點，平均14.8 bp的基因序列中出現1個SNP位點，而在Pt30-2基因片段上檢測了18個SNP位點，平均55.9 bp的基因序列中出現1個SNP位點。非同義突變的位點有123個，靜默突變(同義突變)有61個SNP 位點。

表2　火炬松生長和松脂候選基因片段序列核苷酸變異

1)平均值。

2.3核苷酸多樣性

采用MEGA5.0和DnaSP4.0軟件對各候選基因36個樣本序列進行分析，計算8個候選基因的核苷酸多樣性系數(表3)。8個候選基因平均核苷酸多態性πa和θw分別為0.020和0.016，處于較高水平，其中核苷酸多態性πa的變化范圍介于0.006～0.034，核苷酸多態性θw的變化范圍介于0.003～0.030。這比先前報道的相同樹種其他性狀或不同樹種同類性狀相關基因的核苷酸多態性高(表4)。有報道顯示，火炬松的材性和生長性狀相關基因的核苷酸多態性平均為0.005 9[4,8,16]，是本研究的0.3倍。Pot等[17]報道，海岸松P.pinaster和輻射松P.radiata材性方面的核苷酸多態性是0.002 41和0.001 86，分別是本研究的0.12和0.09倍。核苷酸多態性的研究也在其他針葉樹種中有所報道，例如樟子松P.sylvestrisvar.monglica[18-19]，花旗松Pseudotsugamenziesii[9,16,20]和柳杉Cryptomeriajaponica[21]。

在8個候選基因片段中，具有最高核苷酸多態性πa和θw的基因片段分別是ARR17_ARATH(πa=0.034)和SSGP_VOLCA(θw=0.030)，具有最低核苷酸多態性πa和θw的基因片段是Pt30-4和CKX7_ARATH(πa=0.006，θw=0.003)。靜默位點的平均核苷酸多樣性(θwsil)為0.022，該值與非同義突變位點多樣性(πnsyn=0.014)基本相同。本研究與同一樹種的其他性狀如抗旱性、材性和抗性的候選基因相比，核苷酸多樣性θw高出其他相關研究3.2和4.0倍[4,8]?；蚱蜟OGT2_ARATH的非同義突變多樣性(πnsyn)是基因片段CKX7_ARATH的14.5倍，非同義突變位點多樣性在0.029～0.002之間變化(表3)，這表明基因間在適應性進化歷史中變化較大[22]?；蚱蜳t30-2、Pt30-4和CKX7_ARATH的非同義分歧很低，即0.002～0.004，表明這些基因具有很強的保守核苷酸序列。8個候選基因片段中的2個基因片段(Pt30-1和Pt30-4)的Ka/Ks比值大于1，說明這些基因受正向選擇的影響較大。其余基因片段的Ka/Ks比值都小于1，說明他們受負向選擇的影響較大，核苷酸序列相對保守。

表3　火炬松生長和松脂性狀候選基因片段核苷酸多樣性分析1)

1)S為分離位點的數量，θw、πa為總核苷酸多樣性，πsyn、πnsyn分別為同義和非同義突變多樣性，θwsil為靜默位點多樣性，Ks為編碼區同義突變平均數，Ka為編碼區非同義突變平均數，Nh為單倍型個數，He為單倍型多樣性，Rm為歷史重組事件最小數。

單倍型的平均數(Nh)和單倍型多樣性(He)平均值分別為11.25和0.909。在8個候選基因片段中發現核苷酸數和核苷酸多樣性有較大的變化，其中單倍型個數的變化范圍介于6～21，單倍型多樣性變化范圍介于0.625～1.000。采用四配子檢測進行最小歷史重組事件(Rm)估算，結果表明8個候選基因片段的Rm為1～7。

2.4連鎖不平衡和重組

將8個候選基因片段的位點間連鎖不平衡數據(R2)匯總后進行綜合分析，期望從總體上了解火炬松基因組中連鎖不平衡情況。對R2值的非線性回歸分析結果見圖1，隨著候選基因片段核苷酸序列長度的增加，SNPs的連鎖不平衡程度迅速削弱，當長度達400 bp左右時，R2<0.2，連鎖不平衡迅速衰退。這一結果表明，在火炬松中，SNP的連鎖不平衡在候選基因片段內部就已衰退。這與其他的針葉樹種的報道一致[8-9]。連鎖不平衡衰退率在不同的植物中的變化較大，玉米Zeamays的候選基因片段長度為1 500 bp，當在200 bp左右時，R2降低到0.2以下；擬南芥Arabidopsisthaliana的候選基因片段長度為100 000 bp，當在50 000 bp左右時，R2降低到0.2以下[25]。

表4　不同性狀的候選基因核苷酸多樣性在其他林木中的應用1)

1)θw為總核苷酸多態性，πnsyn和πsyn分別為非同義和同義突變多樣性，He為單倍型多樣性。

圖18個候選基因片段總體連鎖不平衡分析的R2隨堿基對長度衰減情況

Fig.1Scatter plot of distances in base pairs and linkage disequilibrium estimates (R2) between SNP sites in eight candidate genes in Pinus teada

3討論與結論

火炬松是南方商品林的主要樹種之一，適宜在粵北和粵東北低山種植?；鹁嫠傻倪z傳改良時間較長，目前正處在第2代向第3代過渡階段。在火炬松第1、2代育種過程中，生長量獲得顯著提高，但忽略了對產脂量的選擇。為了適應林業生產對松樹多用途的需求，本研究以高產脂和速生為目標，選擇了8個候選基因片段，其中4個基因片段與松脂合成有關，4個基因片段與火炬松生長(包括生長素和細胞分裂素)有關，將8個候選基因片段進行PCR擴增測序，共得到5 177 bp的基因片段序列，其中編碼區的序列長度為3 322 bp，非編碼區的序列長度為1 855 bp。非同義突變SNP位點(123)多于靜默SNP位點(61)。8個候選基因片段的SNP篩選分析研究表明，編碼區的SNP數量高于非編碼區，與其他松樹的SNP分析結果一致，表明火炬松的編碼區比其他部位具有更高的保守性。但是不同候選基因的 SNP 頻率不一樣，說明各個基因的保守性不同，可能是由于在進化過程中受到的選擇壓力不同所致。

8個候選基因片段的平均核苷酸多樣性πa和θw分別為0.020和0.016，與先前報道的核苷酸多樣性相比，本研究8個候選基因片段的核苷酸多樣性較高，這可能是因為材料具獨立的變遷歷史和地理分布，不同的遺傳基礎造成了核苷酸多樣性的差異，今后應更大范圍取樣以便更全面地了解該樹種的遺傳多樣性水平。另一部分原因可能是本研究所用的材料為針葉部位，這個部位的基因組比大配子體復雜。8個候選基因片段的單倍型個數(Nh)和單倍型多樣性(He)平均值分別為11.25和0.909，單倍型多樣性的平均標準誤為0.065，Rm為1～7。本文檢測到了較高程度的核苷酸多樣性，表明利用SNP標記對火炬松進行分子標記輔助選擇(MAS)需要較多的SNP 標記。

本研究發現，隨著LD衰退距離的增加，總體趨勢基本平穩，但火炬松8個候選基因片段總體的LD水平稍高，這可能是由于所選樣品數量較少。Kim等[26]提出當個體遺傳背景差異較小時，較大的樣本量一般具有較低的LD水平。大量研究表明林木具有較低的LD水平，適宜基于候選基因片段的連鎖不平衡作圖研究。在楊樹中，基于SNP的連鎖不平衡檢測發現，楊屬Populus近緣種的候選基因片段內LD衰退距離為300～1 700 bp不等[22,27-29]。Thumma等[30-31]發現亮果桉EucalyptusnitensLD水平在基因CCR和COBRA-like內已衰退至不明顯。在針葉樹種中，基于SNP標記的LD水平在幾千個堿基長度內已衰退至不明顯[8-10,32]，這些研究結果與本研究的LD檢測基本一致，揭示了基于候選基因片段的關聯遺傳研究是可行的。本研究進行的連鎖不平衡分析僅限于候選基因片段內部,火炬松基因間隔區域、不同染色體及全基因組水平的LD需要更多的標記去驗證。隨著火炬松全基因組測序、拼接、注釋完成及重測序研究的開展，該物種基因組水平的LD衰退趨勢將會得到更深入全面的檢測。

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【責任編輯李曉卉】

Analysis of single nucleotide polymorphisms within candidate genes

involved in growth and resin biosynthesis of loblolly pine

YANG Huixiao1,2， LIU Tianyi2, XU Bin1, LIU Chunxin2, WANG Jinbang3, HUANG Shaowei2

(1 Guangdong Academy of Forestry, Guangzhou 510520, China; 2 Guangdong Key Laboratory for Innovative Development and

Utilization of Forest Plant Germplasm/College of Forestry and Landscape Architecture, South China

Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 3 Yingde Institute of Forestry, Yingde 513000, China)

Abstract：【Objective】 Single nucleotide polymorphisms (SNPs) within candidate genes involved in growth and resin biosynthesis of loblolly pine，Pinustaeda, were screened and analyzed, preparing technical basis for later marker-assisted breeding.【Method】The candidate unigenes related to auxin, gibberellins, cytokinins or pinene synthesis were selected from loblolly pine cDNA library using bioinformatics. The sequences of eight candidate genes from 36 loblolly pine individuals were aligned and compared using MEGA5.0 and DnaSP4.0 softwares.【Result】 The total length of measured sequences was 5 177 bp. There were 184 SNPs to be detected, and in average there was one SNP site in every 36.9 bp sequence. Among them, 123 were nonsynonymous SNPs and 61 were silent SNPs. The levels of nucleotide diversity for sequenced regions represented byπaandθwwere 0.020 and 0.016, respectively. The linkage disequilibrium(LD) of SNPs in the eight candidate genes declined rapidly (R2≤0.2) with the nucleotide sequences increased in length. 【Conclusion】 LD mapping of SNPs in the five candidate genes are useful for loblolly pine breeding.

Key words：loblolly pine; candidate gene; single nucleotide polymorphism (SNP); linkage disequilibrium (LD)

中圖分類號：S722.3

文獻標志碼：A

文章編號：1001-411X(2016)01-0075-07

基金項目：廣東省林業科技創新專項資金(2011KJCX013-02)；“十二五”農村領域國家科技計劃專題(2012BAD01B0203)；聯合國發展計劃署援建的火炬松改良種子園項目(CPR/91/153，1992-1996)

作者簡介：楊會肖(1981—)，女，助理研究員，博士研究生，E-mail: hxyang@sinogaf.cn；通信作者：黃少偉(1964—)，男，教授，博士，E-mail: shwhuang@scau.edu.cn

收稿日期：2015-04-07優先出版時間：2015-12-07

優先出版網址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20151207.1133.028.html

楊會肖， 劉天頤， 徐斌，等.火炬松生長和松脂性狀相關候選基因的單核苷酸多樣性分析[J].華南農業大學學報，2016,37(1):75-81.