苦楝SRAP分子標記及遺傳多樣性分析

陳麗君， 劉明騫， 廖柏勇， 李俊成， 陳曉陽

(1 華南農業大學 試驗中心, 廣東 廣州 510642；2 華南農業大學 華南農業博物館籌建辦公室， 廣東 廣州 510642；3 廣東省森林植物種質創新與利用重點實驗室/華南農業大學 林學與風景園林學院， 廣東 廣州 510642)

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苦楝SRAP分子標記及遺傳多樣性分析

陳麗君1， 劉明騫2， 廖柏勇3， 李俊成3， 陳曉陽3

(1 華南農業大學 試驗中心, 廣東 廣州 510642；2 華南農業大學 華南農業博物館籌建辦公室， 廣東 廣州 510642；3 廣東省森林植物種質創新與利用重點實驗室/華南農業大學 林學與風景園林學院， 廣東 廣州 510642)

摘要：【目的】為快速分析苦楝Meliaazedarach不同種源提供方法，揭示苦楝遺傳多樣性，為苦楝的開發、利用及選擇育種提供一定的理論依據?！痉椒ā繌?83對SRAP引物組合中篩選出20對多態性較高的引物組合，對苦楝國內全分布區的37個種源和肯尼亞1個種源樣品進行SRAP遺傳多樣性分析?！窘Y果】20對引物組合共擴增出242條譜帶，其中多態性條帶101條，多態性百分率平均值為40.89%，每對引物組合擴增條帶5～17條，平均每對引物擴增條帶12.1條；其多態性信息量(Polymorphism information content，PIC)值介于0.188～0.488，平均值為0.299?；赨PGMA法聚類以0.350為閾值可將38個苦楝種源劃分為7類，在此基礎上，去掉2個種源，將其余36個種源劃分5個地理類群?！窘Y論】SRAP分子標記可以很好地反映苦楝的遺傳多樣性，聚類類群劃分結果有明顯的地理趨勢和氣候生態特征。

關鍵詞：苦楝； 種源； 遺傳多樣性； SRAP

苦楝Meliaazedarach又名翠樹、楝樹、紫花樹、森樹等，為楝科楝屬落葉喬木，分布于中國、韓國、日本、印度、斯里蘭卡、印度尼西亞和澳大利亞等地，歐洲、美洲也有栽培[1]?？嚅L速度快、木材材質優良、紋理美麗，易加工，可用于家具、建筑、農具、船舶、樂器等方面，木材抗白蟻、抗蟲蛀、耐腐?？嚅蜔焿m、能大量吸收有毒有害氣體，是優良的城市及工礦區綠化樹種，也是我國南方四旁綠化常用樹種[2-3]?？嚅母?、皮、花、果均可入藥，也可作為植物源農藥[4]。分子標記是繼形態學標記、細胞學標記、生化標記之后最為可靠的遺傳標記技術[5～6]。目前已有少量文獻對部分苦楝種源的遺傳多樣性進行分析，程詩明[7]采用7對AFLP引物對分層隨機抽樣的8個群體240個個體基因組進行研究分析，共擴增得到658條清晰譜帶，其中650條為多態性譜帶，各群體多態位點百分率為51.4%～76.29%；陳羨德[8]利用篩選出的20個RAPD引物對15個不同來源的苦楝進行分析，20個隨機引物共擴增出193條重復性好、清晰的譜帶，其中多態性譜帶共計189條，占97.9%。夏海濤[9]采用篩選出的24個簡單重復序列間多態性(Inter-simple sequence repeat，ISSR)引物對13個種源苦楝優樹DNA進行分析，共擴增出382個位點，多態位點百分率為98.43%，其中南寧和倉山種源的多態位點百分率最高，為54.97%，延平的多態位點百分率最低，為43.98%，說明13個種源苦楝的遺傳多樣性豐富。但是，苦楝分布廣泛，以前的研究采樣點偏少，不足以準確地反映全分布區苦楝的遺傳多樣性。本項研究從國內18個省(區、市)37個縣(市)采集苦楝種子，并收集肯尼亞內羅畢苦楝種子，采取相關序列擴增多態性(Sequence-related amplified polymorphism, SRAP)分子標記方法進行遺傳多樣性分析。此外，SRAP分子標記結合了擴增片段長度多態性(Amplified fragment length polymorphism, AFLP)及隨機擴增的多態性DNA(Random amplified polymorphic DNA, RAPD)各自的優點，方便快速，只需要極少量DNA材料，且不需要預先知道DNA序列信息，即可快速獲得大量的信息，試驗結果穩定可靠，且再現性較高，重復性較好[10～11]。

1材料與方法

1.1試驗材料

以國內全分布區的37個種源和肯尼亞內羅畢1個種源為對象進行苦楝SRAP遺傳多樣性分析，采種點地理位置及編號見表1。試驗材料采于廣州市華南農業大學苗圃1年生苦楝，采集幼嫩枝條上嫩葉6～8片，低溫保存用于提取DNA。

1.2試驗儀器與設備

試驗儀器主要有超微量紫外分光光度計(Thermo nanodrop 2000)，PCR擴增儀(PTC-200)，DYY-Ⅲ型恒壓恒流電泳儀(北京六一儀器公司)，凝膠成像系統(Bio-rad)，高速離心機(Eppendorf)等。試驗用TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg2+及100 bp DNA ladder 等購自TaKaRa公司，瓊脂糖和Gold View核酸染料購自廣州鼎國生物科技有限公司，酚、三氯甲烷、乙醇、異丙醇、硫代硫酸鈉、硼酸、甲醛、冰醋酸、硝酸銀等其他試劑為國產分析純。SRAP引物由上海生工生物工程有限公司合成，本研究所用引物序列見表2。

表1　苦楝材料及來源

表2　用于苦楝SRAP分析的引物序列

1.3苦楝DNA提取和SRAP-PCR擴增

苦楝基因組 DNA 提取參照上海生工生物工程有限公司柱式基因組 DNA 提取試劑盒說明書。所提取的基因組DNA用8 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測質量，超微量紫外分光光度計檢測濃度后稀釋至50 ng·μL-1，置于-20 ℃條件下保存備用。通過單因子及正交試驗建立并優化苦楝SRAP-PCR最佳反應體系為模板DNA 30 ng、dNTPs濃度0.125 mmol·L-1、Mg2+濃度2.25 mmol·L-1、引物濃度0.48 μmol·L-1、TaqDNA聚合酶0.75 U(25 μL)。SRAP-PCR反應程序為: 94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，35 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，5個循環；94 ℃變性1 min，50 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。

1.4數據統計與分析方法

電泳結果統計時將具有相同遷移率的擴增片段，按0/1系統紀錄，有帶記為1，無帶記為0，并參照標準Marker帶估計擴增片段的大小，形成0/1矩陣。將圖形資料轉換成數據資料，并輸入Excel 2007中建立0/1數據矩陣，使用NTSYS-pc2.10e軟件計算遺傳距離和相似系數，使用非加權平均法(UPGMA)進行聚類分析。

2結果與分析

2.1SRAP擴增多態性條帶統計

本研究采用20對SRAP引物對苦楝38個不同種源進行擴增，分析結果見表3。由表3可知，引物擴增條帶多數集中在100～1 500 bp之間，20對引物組合對全部樣品進行分析，共擴增出247條帶，其中多態性條帶101條，平均多態性百分率為40.89%。20對引物擴增的條帶數從5條(Me11/Em29)到17條(Me20/Em7)不等，平均為12.1條。多態性條帶的數量從1條(Me11/Em29、Me6/Em29)到12條(Me20/Em7)不等，多態性比率最高的引物組合為Me24/Em14(88.89%)，其次為Me20/Em7(70.59%)、Me1/Em9(60.00%)；多態性比率最低的引物組合為Me6/Em29(12.50%)，總體而言，引物多態性比率較高。

多態性信息量(Polymorphism information content，PIC)是用來衡量不同引物對反應多態性高低的程度，20對引物組合的PIC為0.188～0.488，其中Me1/Em9擴增引物總條帶數(15條)、多態性條帶數(9條)以及PIC(0.387)均較高，該引物組合可以成為苦楝SRAP分子標記的骨干引物[12]，20對引物的平均PIC為0.299，介于0.25～0.50之間，說明所選的SRAP引物可以很好地反映苦楝的遺傳多樣性[13]。引物Me1/Em9的擴增圖譜見圖1。

2.238個不同苦楝種源的聚類分析

根據SRAP標記分析結果，對苦楝38個種源間基于Nei’s的遺傳距離進行UPGMA聚類分析，從聚類分析結果(圖2)可知，以0.350為閾值，38個種源可以分為7類，A04、A09、B01、B04、B06、C02、C03、C10、H03、H06、Z01為第1類，這一類主要分布在海南、廣東、廣西等地理位置偏南的地區，其中肯尼亞內羅畢的種源Z01也在這一類；B03、E02、E03、F01、F04、I01、J01、J02、K02為第2類，這一類主要分布在廣東、福建、浙江、江蘇東部沿海省份；E01、G01、G03、I02、J03、K01、L01、M02、P03、P04、U01為第3類，主要分布在湖南、湖北、陜西、河北等地；D01、D05、M01為第4類，主要為云南種源；Q01、Q02為第5類，來自甘肅。O01和C04各為一類，分別來自河南內鄉和廣西永福。

表3　SRAP引物組合擴增信息分析

M：100 bp DNA ladder；1～38分別為種源編號A04、A09、B01、B03、B04、B06、C02、C03、C04、C10、D01、D05、E01、E02、E03、F01、F04、G01、G03、H03、H06 、I01、I02、J01、J02、J03、K01、K02、L01、M01、M02、O01、P03、P04、Q01、Q02、U01、Z01的DNA。

圖1Me1/Em9引物對苦楝群體材料的擴增聚丙烯電泳圖

Fig.1Amplified products of samples from different provenances of Melia azedarach on polyacrylamide gels with the primer combination of Me1/Em9

圖2　SRAP標記的38個苦楝種源UPGMA聚類圖

3討論

本試驗從783對引物組合中篩選獲得多態性較好的引物組合20對，這些引物組合多態性百分率平均為40.89%，PIC平均為0.299，說明SRAP分子標記可以較好地應用于苦楝的遺傳多樣性分析[13]，并為充分開發、利用苦楝資源及完善苦楝遺傳背景分析奠定基礎。通過本試驗開發出了多態性比率和PIC均較高的可用于苦楝SRAP分析的骨干引物(Me4/Em5、Me1/Em9)，可將大部分種源劃分為準確的類型，為快速分析苦楝不同種源提供了方法。

根據SRAP標記分析結果，以0.350為閾值，可將38個苦楝種源劃分為7類。其中，O01和C04各為一類，分別來自河南內鄉和廣西永福。由于這2類僅各含1個種源，代表性不強，為穩妥起見，河南內鄉和廣西永福暫不獨立成類，將其余的36個種源，劃分5個類群?？嚅N源類群劃分有明顯的地理趨勢和氣候生態特征。例如第1類群的種源來自海南、廣東、廣西等偏南省份，屬于緯度較低，沿海地區的苦楝，這些地方水熱條件充足?？夏醽唭攘_畢種源聚在此類，這可能因為當地氣候條件與我國兩廣、海南島的氣候更相似；第2類群種源主要分布在廣東、福建、浙江、江蘇東部沿海省份，其氣溫和降水量普遍低于第1類種源地；第3類群種源主要分布在湖南、湖北、陜西、河北等地，其氣溫和降水量低于第2類種源地；第4、5類群分別為云南、甘肅種源，兩地區的氣候差異很大，與前3類也有較大差異。

將該聚類結果與苦楝果核及種子性狀做比對[14]，果實主要表型特征為第1類的果實種子形態較小且質量較輕、棱粒較??；第2類的果實果核棱紋明顯、果核單果棱數及粒數較少；第3類的果實種子較寬，果核形態近球形且棱紋不明顯；第4類的果實種子形狀較大且質量較重，果核皮較厚，果核單果棱數較多，但種粒數較少；第5類的果實果核和種子的質量及形態較大，核果皮較厚且棱紋較明顯，果核單果棱數及粒數較多。

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【責任編輯柴焰】

Analysis of genetic diversity of Melia azedarach with SRAP markers

CHEN Lijun1, LIU Mingqian2, LIAO Boyong3, LI Juncheng3, CHEN Xiaoyang3

(1 Center for Teaching & Research Base, South China Agricultural University， Guangzhou 510642, China；

2 Preparation Office of South China Agricultural Museum, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China;

3 Guangdong Key Laboratory for Innovative Development and Utilization of Forest Plant Germplasm/College of

Forestry and Landscape Architecture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

Abstract：【Objective】 To set up a method for rapid detection of different provenances, to investigate the genetic diversity, and to provide a theoretical basis for development, utilization and selective breeding ofMeliaazedarach.【Method】 Twenty SRAP primer combinations (PCs) with relatively high polymorphisms from 783 PCs were selected to analyze the genetic diversity of 37 provenances from all distribution areas nationwide and 1 provenance from Kenya. 【Result】The results showed 242 clear bands were amplified by 20 PCs, among which 101 bands (40.89%) were polymorphic. The number of bands of each PC ranged from 5 to 17, with an average of 12.1. The polymorphism information content (PIC) values of these PCs ranged from 0.188 to 0.488, with an average of 0.299. Thirty-eight provenances could be divided into 7 categories based on UPGMA (with a threshold value of 0.350), and furthermore, by excluding 2 provenances, the rest 36 provenances could be divided into 5 geographic groups. 【Conclusion】SRAP markers can be used to effectively evaluate the genetic diversity ofMeliaazedarach, and the results of cluster analysis demonstrate clear geographical trends and climatic-ecological characteristics.

Key words：Meliaazedarach; provenance; genetic diversity; SRAP

中圖分類號：S792.33

文獻標志碼：A

文章編號：1001-411X(2016)01-0070-05

基金項目：廣東省林業科技創新項目(2011KJCX002)

作者簡介：陳麗君(1989—)，女，碩士， E-mail：chenlijun0311@163.com；通信作者：陳曉陽(1958—)，男，教授，博士，E-mail：xychen@scau.edu.cn

收稿日期：2015-03-13優先出版時間：2015-12-07

優先出版網址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20151207.1133.026.html

陳麗君， 劉明騫， 廖柏勇，等.苦楝SRAP分子標記及遺傳多樣性分析[J].華南農業大學學報，2016,37(1):70-74.