魚藤屬植物內生青霉菌代謝產物的提取及殺蚜活性分析

孫　濤， 孫之潭， 胡美英， 鐘國華

(華南農業大學 昆蟲毒理研究室，廣東 廣州 510642)

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魚藤屬植物內生青霉菌代謝產物的提取及殺蚜活性分析

孫濤?， 孫之潭?， 胡美英， 鐘國華

(華南農業大學 昆蟲毒理研究室，廣東 廣州 510642)

摘要：【目的】從魚藤屬Derris植物的內生真菌中篩選代謝物具有殺蟲活性的內生真菌，并驗證其代謝產物的殺蚜活性?！痉椒ā恳悦~藤D.elliptica、白花魚藤D.alborubra、蜜花魚藤D.thyrisiflora和肇慶魚藤D.hacei等魚藤屬植物的內生真菌為研究對象，采用經典形態學方法鑒定所分離內生真菌，對其代謝產物進行高效液相色譜(HPLC)檢測，篩選出目的菌株。利用不同提取方法和提取溶劑優化目的菌株代謝產物的提取，采用浸蟲法研究其代謝產物的殺蚜活性?！窘Y果】從毛魚藤根部篩選到1株代謝產物具有殺蟲活性的內生青霉菌，其菌絲體的提取試驗和發酵液的萃取試驗表明，三氯甲烷是最好的提取溶劑和萃取溶劑，超聲波法能夠有效提取內生青霉菌絲體中的殺蟲活性物質，提取率達4.156%。三氯甲烷提物對蘿卜蚜成蚜活性最高，24和48 h的LC50分別為1.570和0.953 mg·mL-1?！窘Y論】確定了魚藤屬植物內生真菌代謝產物的提取方法，并證實了代謝產物具有類似魚藤酮的殺蟲活性，其具體化學結構仍待進一步確證。

關鍵詞：魚藤； 內生真菌； 代謝產物； 蘿卜蚜

為了適應復雜的生態環境，自然界中絕大多數植物都與某類微生物共生著， 形成多種形式的植物-微生物共生體系統[1]。隨著對植物-微生物共生體系統的深入研究， 內生真菌作為一種新的微生物資源受到了廣泛的關注。 至于內生真菌的定義，根據現在普遍接受的觀點， 是指那些在某一段時期生活在植物體內， 但對寄主植物組織并不引起任何明顯病害癥狀的真菌[2]。 此定義實際上包括那些專性寄生真菌、營表面腐生的腐生真菌、潛伏性病原真菌和菌根真菌。 內生真菌在進化過程中與植物寄主建立了和諧的共生關系, 其次生代謝產物十分豐富，具有多種生物活性如抗腫瘤、抗蟲、抗病等，其中某些產物與宿主的次級代謝產物相同或相似[3]。自Strobel等[4]在1993年首次從短葉紅豆杉內生真菌—安德氏紫杉霉Taxomycesandreanae的發酵產物中分離出抗癌活性物質——紫杉醇以來， 從藥用植物內部篩選與開發具有藥用價值的真菌資源， 尋找新的抗菌活性物質， 進而為植物源藥物的生產開辟新途徑， 已成為該領域的研究重點與熱點。

近年來， 植物內生真菌及其次生代謝物在醫學方面的研究較多， 在農業上應用的研究也逐漸成為熱點。 目前農用內生真菌的研究主要集中在2個方面： 一是農作物的內生真菌對農作物本身的影響； 二是對植物內生真菌次生代謝產物的研究， 重點是發現具有農用生物活性的新化合物[5]。國外有文獻報道：從巴布達橄欖Bontiadaphnoides中可分離得到多節孢屬內生真菌Nodulisporium sp．，該菌會產生一種具有殺滅大蒼蠅幼蟲活性的吲哚二萜類球孢子酸(Nodulisporic acids)[6]。從蓖麻Ricinuscommunis中可分離到1株鏈格孢屬霉Alternariasp.，其發酵產物中可分離得到具有抑制乙酰膽堿酯酶活性的物質，低濃度即對斜紋夜蛾Spodopteralitura具有較高的致死率[7]。從天然產物中發現新型先導化合物， 是新農藥創制的重要途徑。 內生真菌憑借其可增強作物抗逆性、促進作物生長和防治病蟲害的特點，滿足防治效果好、環境影響低、成本較低和節省農藥等植保方面的要求，將成為新農藥研發的重點方向[8]。 目前魚藤酮主要從魚藤的根中提取，受到自然資源相對匱乏的限制， 而組織培養的費用較高， 很難應用于農業生產實際。 本研究以傳統殺蟲植物魚藤的內生真菌為研究對象， 以期從中發現具有產生類似魚藤酮的殺蟲活性物質的內生真菌，以改善魚藤資源匱乏的局面。

1材料與方法

1.1供試菌株

魚藤內生青霉菌Penicilliumsp.菌株及其他菌株均為筆者從華南農業大學昆蟲毒理研究室殺蟲植物標本園內的毛魚藤Derriselliptica、白花魚藤D.albo-rubra、蜜花魚藤D.thyrsiflora和肇慶魚藤D.hacei等魚藤屬殺蟲植物中分離得到。

1.2培養基

固體培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)[9]。馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH自然。馬鈴薯去皮，切成塊煮沸2 min，打漿1～2 min，沖洗打漿機，再加葡萄糖和瓊脂，溶化后補足水至1 000 mL。

液體培養基：馬鈴薯葡萄糖液體培養基(PD)。

1.3供試昆蟲

蘿卜蚜Lipaphiserysimi:同翅目蚜科，采自華南農業大學教學試驗農場及昆蟲毒理研究室試驗菜地，蚜蟲采回后，挑選生長良好、大小一致的無翅成蚜進行試驗。

1.4內生真菌的分離、純化和培養

采用內生真菌常用的分離方法：采集新鮮供試植物的根和嫩枝，進行表面消毒。首先分別以自來水和無菌水沖洗3～4次，然后用體積分數為75%的乙醇漂洗5～15 min， 并用無菌水沖洗3～4次，再置于次氯酸鈉溶液 (有效氯體積分數為10%) 漂洗1 min，最后用無菌水沖洗 4次。 在超凈工作臺上將消毒過的植物組織切割成0.5 cm×0.5 cm小片， 移入PDA平板上，于25 ℃培養箱中恒溫培養。 3～5 d待植物樣品邊緣長出菌絲體后，根據菌絲體的形態特點(包括菌絲體的顏色、形狀和質地等)，采用尖端菌絲體挑取法對不同菌株進行分離純化。 采用組織印跡法檢驗植物組織的滅菌效果：即將消毒而未切割的植物組織與固體平板接觸3～5 min，培養3～5 d，根據平板上菌落的有無判定分離結果的有效性[10]。

內生真菌的液體培養采用搖瓶發酵法。將純化菌株在無菌條件下接入裝有150 mL PD培養基的500 mL三角瓶中，將其置于搖床中(25～28 ℃，RH 75%～85%，光照∶黑暗=12 h∶12 h)培養，搖床轉速120 r·min-1，培養7～9 d。

1.5內生真菌活性物質的提取

用100目篩將菌絲體由發酵液濾出，置于45 ℃烘箱中鼓風烘干，得干菌絲體。

方法1(冷浸法)：稱取一定量的干菌絲體，加入10倍體積的甲醇。置于避光暗處，冷浸每次持續48 h以上，浸提3次，提取液合并，減壓濃縮得粗提物。

方法2(組織研磨法)：稱取一定量的干菌絲體，移入研缽中，再加入適量甲醇，研磨至菌絲體完全粉碎，然后倒出，浸泡提取，提取液減壓濃縮得粗提物。

方法3(超聲波提取法)：稱取一定量的干菌絲體，加入10倍體積的甲醇，置于超聲波儀上，在室溫下提取3～5 min，過濾。 反復提取3次，濾液合并，濃縮得到超聲波粗提物。

方法4(索氏抽提法)：稱取一定量的干菌絲體，用濾紙包好放入索氏提取器中，加入20倍量的甲醇回流至溶劑為無色時停止。 將提取液在旋轉蒸發儀內減壓濃縮，得粗提物。

1.6發酵液中活性物質的萃取

采用液-液分配萃取法：量取一定量的發酵液，用等體積的有機溶劑對發酵液萃取3次，然后將有機相45 ℃減壓濃縮得粗提物，放入冰箱中備用。

1.7內生真菌活性物質的分析

對菌絲體甲醇提取物進行高效液相色譜分析(HPLC)，以篩選產魚藤酮或其類似物的內生真菌。 HPLC的檢測條件：HP-1000型高效液相色譜儀為美國惠普公司制造；HEWLWTT PACKARD色譜柱(ODS HYPERSIL，5 μm，125 mm×4 mm)；檢測波長=295 nm；流動相為V(甲醇)∶V(水)=75∶25；流速為1 mL·min-1；檢測靈敏度AUFS=0.001；柱溫為常溫；進樣量為10 μL。 魚藤酮純品，質量分數為97%，購自美國Sigma公司。

1.8對蘿卜蚜的毒殺活性測定

對蘿卜蚜的毒殺活性測定采用浸蟲法。 挑取30～50頭成蚜放在新鮮的芥藍葉中，放置 1～2 h穩定后，在供試樣品溶液中浸3 s后取出，用濾紙吸除多余溶液，待溶劑干后放入墊有保濕濾紙的9 cm培養皿。 稀釋溶劑為V(丙酮)∶V(水)=1∶1的溶液，按下列公式計算死亡率和校正死亡率：

2結果與分析

2.1毛魚藤等魚藤屬植物內生真菌甲醇提取物的高效液相色譜分析

對毛魚藤、白花魚藤、蜜花魚藤和肇慶魚藤等魚藤屬植物的內生真菌進行了分離，分離純化的菌株總數為81株。 將所分離純化的菌株進行擴大培養，所得菌絲體甲醇冷浸提取，提取物進行高效液相色譜分析(HPLC)，以篩選產魚藤酮類似活性化合物的內生真菌。 從上面供試的81個菌株中，篩選到1株代謝產物具有魚藤酮類似活性的內生真菌，該菌代謝產物的HPLC圖譜中含有與魚藤酮標樣保留時間相近的色譜吸收峰(圖1)，其是否為魚藤酮或其類似物還有待進一步鑒定。 該內生真菌用經典形態學方法鑒定為青霉屬真菌。 該內生青霉菌株在PDA平板上的菌落呈墨綠色，色彩較暗，培養基背面鮮紅色，可見水珠狀無色滲出液。菌絲體墨綠色、淺黃色，表面光滑。 生長的適溫范圍為21～28 ℃，喜低溫，其分類鑒定地位有待進一步的研究。

A：魚藤酮標樣；B：內生青霉菌代謝產物。

2.2內生青霉菌不同提取方法甲醇提取物對蘿卜蚜的生物活性

用4種常規提取方法對內生青霉菌絲體進行提取，提取率見表1。

采用浸蟲法，對內生青霉菌絲體不同提取方法的甲醇提取物進行了生物活性測定，結果見表2。 從表2中可以看出，4種不同提取方法的提取物對蘿卜蚜均有一定的毒殺活性。 其中， 以超聲波提取法提取物的毒殺效果最強， 處理蚜蟲24和48 h的LC50分別為3.056和1.848 mg·mL-1， 殺蟲活性隨處理時間的增加而增強。 結合前面提取率的研究可以看出， 超聲波提取法提取物的毒殺效果最強可能與其能夠提取內生青霉菌絲體中大量的活性物質有關。

表1　內生青霉菌絲體不同提取方法的提取結果1)

1) 表中結果為3次重復的平均值，同列數據后凡是有一個相同小寫字母者，表示在5%水平差異不顯著(DMRT法)； 提取溶劑為甲醇。

表2　內生青霉菌絲體不同提取方法甲醇提取物對蘿卜蚜無翅成蚜的毒力

1)x為濃度的對數值，y為死亡幾率。

2.3內生青霉菌絲體不同溶劑提取物對蘿卜蚜的生物活性

不同溶劑對內生青霉菌絲體的提取效果如表3。

采用浸蟲法，測定了內生青霉菌絲體6種溶劑提取物對蘿卜蚜成蚜的毒力，其結果見表4。 由表4可以看到，內生青霉菌絲體不同溶劑提取物的活性差異較大，活性最高的是三氯甲烷提取物，24和48 h的LC50分別為1.570、0.953 mg·mL-1。 活性順序依次是三氯甲烷>甲醇>正丁醇>乙醇>丙酮>乙酸乙酯提取物，活性最低的乙酸乙酯提取物24和48 h的LC50分別為4.784、3.631 mg·mL。

表3　內生青霉菌絲體不同提取溶劑的提取結果1)

1) 表中結果為3次重復的平均值，同列數據后凡是有一個相同小寫字母者，表示在5%水平差異不顯著(DMRT法)。

表4　內生青霉菌絲體不同溶劑提取物對蘿卜蚜無翅成蚜的毒力

1)x為濃度的對數值，y為死亡幾率。

2.4內生青霉發酵液不同溶劑萃取物對蘿卜蚜的生物活性

內生青霉發酵液不同溶劑萃取物對蘿卜蚜無翅成蚜的毒力測定結果如表5。內生青霉發酵液的不同溶劑萃取物中以三氯甲烷萃取物對蘿卜蚜成蚜的毒殺活性最強,24和48 h的LC50分別為2.967、1.787 mg·mL-1。 其次為正丁醇萃取物，24和48 h的LC50分別為3.445、2.202 mg·mL-1。 結合前面的活性追蹤過程，三氯甲烷對內生青霉菌的活性物質具有較好的提取效果，提取和萃取試驗的活性測定結果均證實了這一點。

表5　內生青霉發酵液不同溶劑萃取物對蘿卜蚜無翅成蚜的毒力

1)x為濃度的對數值，y為死亡幾率。

3討論與結論

植物與內生真菌的關系是互惠共生的，一方面植物為內生真菌提供光合產物和礦物質；另一方面內生真菌的代謝物能刺激植物的生長發育， 提高宿主植物對生物脅迫和非生物脅迫的抵抗能力[11]。 現代的內共生理論認為，植物與內生真菌在長期的協同進化過程中，生物化學途徑的連續演化會導致信息物質在內生真菌與宿主間的相互傳遞[12]。 這一理論或許能夠解釋某些植物內生真菌可以產生與宿主相同或相似的生理活性成分的原因[13]。 本研究便是以傳統殺蟲植物毛魚藤、白花魚藤、蜜花魚藤和肇慶魚藤等魚藤屬植物的內生真菌為研究對象，對魚藤內生真菌的代謝產物初步進行HPLC檢測，從毛魚藤根部分離到1株代謝產物具有殺蟲活性的內生青霉菌，該菌代謝產物的HPLC圖譜中含有與魚藤酮標樣保留時間相似的色譜吸收峰，其是否為魚藤酮或其類似物還有待進一步鑒定。 蚜蟲為魚藤酮類化合物的敏感試蟲，用魚藤酮噴霧處理甘藍蚜的LC50為7.44 μg·頭-1[14]。 因此本研究采用蘿卜蚜進行生物活性測定，以進一步確定魚藤酮類似活性化合物的產生菌。

內生青霉菌絲體4種方法甲醇提取物的生物活性測定結果表明， 超聲波提取法能夠提取內生青霉菌絲體中大量的活性物質，提取率為4.156%。內生青霉菌絲體6種溶劑提取物和內生青霉發酵液4種溶劑萃取物的生物活性測定結果表明，三氯甲烷是最好的提取溶劑和萃取溶劑。三氯甲烷提取物對蘿卜蚜成蚜24和48 h的LC50分別為1.570、0.953 mg·mL-1；三氯甲烷萃取物對蘿卜蚜成蚜24和48 h的LC50分別為2.967、1.787 mg·mL-1。但本研究中內生青霉菌的代謝產物數量較少， 菌絲體甲醇提取物的產量約為0.15 g·L-1。根據HPLC檢測數據結果來看，魚藤酮類似活性化合物在內生青霉甲醇粗提物中僅為1/1 000左右，不足以完成所有的結構鑒定程序， 因此該內生青霉菌產生的魚藤酮類似活性化合物的具體化學結構仍待進一步確證。

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【責任編輯柴焰】

Extraction of secondary metabolites of Penicillium sp. in Derris

plants and bioactivity assay against Lipaphis erysimi

SUN Tao?, SUN Zhitan?, HU Meiying, ZHONG Guohua

(Laboratory of Insect Toxicology, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

Abstract：【Objective】 To screen out one strain of endophytic fungi which might produce insecticidal secondary metabolites and test its insecticidal activity againstLipaphiserysimi.【Method】Endophytic fungi in insecticidal plants, includingDerriselliptica,D.alborubra,D.thyrsifloraandD.hacei, were studied. Endophytic fungi isolated fromDerrisplants were identified by classical morphological method, and their secondary metabolites were identified using high-performance liquid chromatograph(HPLC) to obtain the objective strains. Various extraction methods and extraction solvents were used to optimize the extraction of secondary metabolites. Insecticidal activity againstL.erysimiwas studied by immersion of the insect bodies.【Result】One strain of endophytic fungi ofPenicilliumsp., which produced insecticidal metabolites, was screened out from the roots ofD.elliptica. Extracting tests on the mycelia and fermentation of endophyticPenicilliumsp. indicated that chloroform was the best extracting solvent, and bioactive compounds could be effectively extracted using supersonic method with an extracting rate of 4.156%. Chloroform extract had the highest efficiency against the adults ofL.erysimi, of which LC50was 1.570 mg·mL-1after 24 h and 0.953 mg·mL-1after 48 h. 【Conclusion】This study determines the extraction method of the secondary metabolites from endophytic fungi ofDerrisplants, and confirmes that these metabolites have insecticidal activity similar to rotenone. However, the specific chemical structures of the secondary metabolites remains to be further confirmed.

Key words：Derris; endophytic fungi; metabolites;Lipaphiserysimi

中圖分類號：S481.1

文獻標志碼：A

文章編號：1001-411X(2016)01-0046-06

基金項目：廣東省自然科學基金(05006634)

作者簡介：孫濤(1989—)，男，碩士研究生，E-mail：nkxsuntao@163．com；孫之潭(1979—)，男，碩士，E-mail：zhitansun2001@yahoo.com；?對本文貢獻相同；通信作者：鐘國華(1973—)，男，教授，博士，E-mail：guohuazhong@scau．edu．cn

收稿日期：2015-04-09優先出版時間：2015-12-07

優先出版網址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20151207.1116.016.html

孫濤， 孫之潭， 胡美英，等.魚藤屬植物內生青霉菌代謝產物的提取及殺蚜活性分析[J].華南農業大學學報，2016,37(1):46-51.