HPLC與UV-VIS法測定骨修復材料復合納米微球中左氧氟沙星的比較*

王琦 陳誠 何小強 黃偉

HPLC與UV-VIS法測定骨修復材料復合納米微球中左氧氟沙星的比較*

王琦 陳誠 何小強 黃偉*

目的 比較高效液相色譜法（High performance liquid chromatography,HPLC）與紫外-可見分光光度計法（Ultraviolet-visible spectroscopy,UV-VIS）檢測納米微球中的左氧氟沙星，為評價可控降解骨修復材料中的藥物緩釋提供方法學。方法 直接測定標準品左氧氟沙星，繪制兩種方法的標準曲線，線性范圍內選低、中、高3個濃度，計算回收率。將10個載藥骨修復材料（10mm×6mm×6mm）分別浸泡于3 mL模擬體液中，1天后取樣，經兩種方法檢測，配對t檢驗，比較兩種方法測得的結果有無統計學差異。結果 HPLC法的線性回歸方程：Y=0.0334X-0.01（r=0.9996），線性范圍：（0.5～250） g/mL。UV-VIS法的線性回歸方程為：Y=0.06588X+0.01669（r=0.9999），線性范圍：（0.5～50） g/mL。HPLC 法在低、中、高濃度的回收率分別為：（96.33±0.58）%、（111.00±0.00）%、（105.00±0.00）%，RSD分別為0.37%、0.17%、0.06%；UV-VIS法的回收率分別為：（96.00±2.00）%、（99.00±0.00）%、（98.66±0.00）%，RSD分別為 1.34%、0.00%、0.03%。HPLC法測得的平均濃度為：（30.43±10.27） g/mL；UV-VIS法測得的平均濃度為：（187.93±33.52） g/mL。兩種方法測得的結果有顯著統計學差異（t=20.169，=0.000）。結論HPLC法專屬性強、回收率高、精確度高，是評價納米微球載左氧氟沙星可控降解骨修復材料中藥物緩釋的理想方法。

左氧氟沙星；骨修復材料；納米微球；高效液相色譜法；紫外可見分光光度計法

左氧氟沙星為第3代喹諾酮類藥物[1]，其作用機制為抑制細菌的Ⅱ型拓撲異構酶，干擾 DNA復制、轉錄過程[2]，其有廣譜抗菌作用[3]，因而廣泛應用于敏感菌引起的各個系統感染[4-7]。本文將磁性介孔硅納米顆粒與左氧氟沙星結合，再與羥基磷灰石、殼聚糖復合，得到一種具有藥物緩釋性能的高分子骨修復復合材料。

目前，檢測左氧氟沙星常用的方法為高效液相色譜法（High performance liquid chromatography,HPLC）[8]、紫外-可見分光光度計法（Uv-visible spectrophotometer,UV-VIS）[9]和微生物法[10]，許多研究者應用這些方法檢測了血漿、片劑、注射液中的左氧氟沙星。本文采用HPLC和UV-VIS兩種方法對所制備復合材料中左氧氟沙星進行了檢測，并對兩種方法的可靠性進行了比較。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（LC-2010AHT，日本島津公司）；高速離心機（SigmaD-37520，美國）；超聲波清洗器（KQ2200B，昆山市超聲儀器有限公司）；Elix10超純水凈化系統（Milli-QGradientA10，美國）；紫外可見分光光度計（UV-2600，日本島津公司）；XS-10510-6電子天平（METTLERTOLEDO，瑞士）；氮氣干燥儀（River Road West Berlin MA 01301，美國）；改良型SBF模擬體液（赫特生物技術有限公司）。四丁基溴化銨（分析純，批號：20141103；國藥集團生產）；環丙沙星對照品（含量≥98%，批號：17850-5G-F,Sigma-Aldrich，美國）；左氧氟沙星標準品（含量≥98%，中國食品藥品檢定研究院，批號：130455-201106）；雙蒸水；甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 HPLC法色譜條件

色譜柱為Sepax BR-C18（250mm×4.6mm 5 m），流動相為0.01mol/L磷酸二氫鉀-甲醇-0.5 mol/L四丁基溴化銨（75∶25∶4），流速1.0 ml/min，柱溫40℃，紫外檢測波長290 nm。進樣量10 L。

1.2.2 標準品溶液的配制

稱15.00mg左氧氟沙星標準品，于模擬體液中溶解，轉移至5mL容量瓶中定量（3mg/mL），倍比稀釋，分13個濃度 梯 度：300、200、100、50、25、10、5、2.5、1、0.5、0.25、0.1、0.05 g/mL。取環丙沙星25.04mg稱定，置于25 mL的容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，稀釋成濃度為500.8 g/mL的內標工作液。

1.2.3 UV-UIS法波長選擇

按1.2.2的方法配制標準品，選高、中、低等多個不同的濃度，儀器調零后，將標準品左氧氟沙星經儀器在200～400nm處掃描，確定最大吸收波長。

1.2.4 繪制標準曲線

建立HPLC法標準曲線：取100 L空白模擬體液，分別將13個不同濃度梯度的10 L標準工作液加入，同時加入10 L內標環丙沙星，渦旋混勻5分鐘，加入800 L二氯甲烷，渦旋5分鐘，8000 rpm/min離心5分鐘。取上清液750 L，50°C水浴下氮氣吹干，加入100 L流動相溶解，超聲、渦旋、12000rpm/min離心10分鐘，取上清液10 L進樣分析。每個濃度分析3次。以左氧氟沙星與內標環丙沙星峰面積的比值（Y）為縱坐標，左氧氟沙星的濃度（X）為橫坐標，用加權最小二乘法（W=1/C2）進行回歸計算。

建立UV-VIS法標準曲線：取3mL空白模擬體液直接掃描并將儀器調零。將不同濃度梯度的標準品掃描，以吸光度值為縱坐標，左氧氟沙星濃度為橫坐標，用加權最小二乘法（W=1/C2）進行回歸計算。

1.2.5 回收率實驗

分別制備左氧氟沙星濃度為5、25、50 g/mL的標準樣品各3份，作為質控樣品，HPLC法按“1.2.4”項下方法處理、檢測。UV-VIS法按1.2.4項下方法處理，實測濃度與理論濃度的比值為方法回收率。

1.2.6 真實樣品測定

HPLC法樣品處理：取10個經-鈷60輻射滅菌的新型納米微球載左氧氟沙星可控降解骨修復材料（大?。?0 mm×6mm×6mm），分別浸泡于裝有3 mL改良型模擬體液的EP管中，于37°C恒溫箱浸泡24小時，隨后將材料取出，樣品置于-20°C冰箱保存，備測。其余步驟同1.2.4項，每個濃度分析3次。UV-VIS法樣品處理：將同一批次的10個樣品，用模擬體液稀釋100倍后，取3 mL裝入石英比色皿，在特定波長掃描，記錄吸光度值，代入標準曲線，得藥物濃度。

1.3 統計方法

使用SPSS19.0統計軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩種方法測定結果比較采用配對檢驗。＜0.05為差異有統計學意義。相對標準偏差（RSD）=標準偏差（SD）/計算結果的算術平均值（X）×100%。

2 結果

2.1 HPLC法色譜條件

左氧氟沙星和內標環丙沙星的保留時間分別為4.84分鐘和6.74分鐘，其余雜質對樣品的測定無干擾，兩者峰形良好，分離完全。樣品色譜圖（圖1a、b）。

圖1 HPLC法與UV-VIS法的各組色譜圖及標準曲線

2.2 UV-VIS法波長選擇

將模擬體液作為空白對照組與加入標準品左氧氟沙星的樣品作為實驗組進行掃描，可以發現不同濃度的標準品左氧氟沙星在288.4 nm處有最大吸收波長，故選288.4 nm作為UV-VIS法檢測樣品的波長（圖2 a）。（彩圖見插頁）

圖2 不同濃度左氧氟沙星的圖譜

2.3 標準曲線

HPLC法的回歸方程：Y=-0.01+0.0334X（r=0.9996），線性范圍：（0.5～250） g/mL。UV-VIS法的回歸方程為：Y=0.06588X+0.01669（r=0.9999），線性范圍：（0.5～50） g/ mL。標準曲線如圖（圖1c、f）。

2.4 回收率實驗

HPLC法測定低、中、高（5、25、50 g/mL）3個濃度的標準品,其回收率分別為（96.33±0.58）%、（111±0.00）%、（105±0.00）%，RSD分別為0.37%、0.17%、0.06%。UV-VIS法測定低、中、高（5、25、50 g/mL）3個濃度的標準品,其回收率分別為（96.00±2.00）%、（99.00±0.00）%、（98.66±0.00）%，RSD分別為1.34%、0.00%、0.03%。達到了藥典規定的回收率范圍：80%～120%。

2.5 真實樣品測定

UV-VIS法測得的10個樣品均值為（187.93±33.52） g/ mL，HPLC法測得的10個樣品均值為（30.43±10.27）g/mL。兩組結果進行配對t檢驗，兩種方法測得的結果有顯著統計學差異（t=20.169，=0.000）。以UV-VIS測得的結果為Y，以HPLC測得的結果為X進行相關性分析，其線性方程為Y=2.94X+98.57，相關系數r=0.899（=0.000）（圖3）。

圖3 兩組結果進行相關性分析

3 討論

慢性骨髓炎是骨與骨髓的慢性感染[11]，發病率逐漸增高[12]，臨床上治療非常棘手。左氧氟沙星具有廣譜抗菌且分子量較小[13]，可將其裝載于磁性介孔硅納米微球，合成一種新型載藥可控降解骨修復材料，用于治療慢性骨髓炎。為了客觀評價納米微球載藥可控降解骨修復材料中藥物在體內外的緩釋特點，建立正確的方法是必要的。目前檢測左氧氟沙星常用的方法為：HPLC法[8,13]、UV-VIS法[9]、微生物法[10]。

HPLC法的流動相開始為0.01mol/L磷酸二氫鉀-甲醇溶液，左氧氟沙星出峰處有拖尾現象，加入四丁基溴化銨[14,15]離子對試劑后，拖尾消失。最終將流動相確定為：0.01mol/ L磷酸二氫鉀-甲醇-0.5mol/L四丁基溴化銨。環丙沙星化學性質與左氧氟沙星類似，故將其作為內標[16]。兩者極易溶解于有機溶劑中，因此選二氯甲烷作為萃取劑，為了保證充分萃取樣品中的藥物，樣品與萃取劑的比例為1:8[17]。HPLC法的回收率在96%～105%之間，達到了《中華人民共和國藥典》規定的波動范圍：80%～120%[18]。

當測定無雜質干擾的標準品時，兩種方法均有較高的回收率且達到了藥典規定的要求，但UV-VIS法測定真實樣品時的圖譜較標準品發生明顯改變，考慮有雜質干擾左氧氟沙星的吸光度，雜質會干擾 UV-VIS測定的準確性。UV-VIS法的線性范圍較HPLC窄，回收率在96%～98%之間，分析原因為 UV-VIS工作原理為朗伯比爾定律[19,20]，吸光度值（A）與其透射比的倒數（1/T）成對數函數關系，所以吸光度值與濃度只在較小的范圍內成線性關系。

同一批樣品經UV-VIS法檢測的濃度明顯高于HPLC法，兩組結果呈現正相關線性關系。UV-VIS法操作簡單，成本較低，但無法排除雜質的干擾，線性范圍較窄。由于不同材料載藥量的差異，藥物緩釋量有較大差異，會超出UV-VIS法的線性范圍，最終導致UV-VIS法無法測出藥物濃度。左氧氟沙星標準品是在288.4nm波長處出峰，將真實樣品直接通過UV-VIS測定，由于雜質干擾、藥物濃度過高等因素，超過UV-VIS法的可響應的吸光度值，左氧氟沙星不能測出（圖2 b，紅色線條）。將真實樣品稀釋一定倍數之后檢測，雖然吸光度值在線性范圍內，但考慮有雜質使得吸光度值增加，從而使UV-VIS測定的結果偏高。因此，UV-VIS法不能達到測定的要求。HPLC法可以將樣品中各種雜質在色譜柱中進行分離，排除了雜質對左氧氟沙星的干擾，專屬性強，精度高、回收率高。綜上所述，HPLC法是評價納米微球載左氧氟沙星可控降解骨修復材料藥物緩釋的理想方法。

[1]Das A,Mukherjee J,Dey G,et al.Bioequivalence study of levofloxacin tablets in healthy Indian volunteers using HPLC[J].Arzneimittelforschung,2011,61(1):61-65.

[2]Torres A,Liapikou A.Levofloxacin for the treatment of respiratory tract infections[J].Expert Opin Pharmacother,2012,13(8) : 1203-1212.

[3]Kuti JL,Nicolau DP.Presence of infection influences the epithelial lining fluid penetration of oral levofloxacin in adult patients[J].Int J Antimicrob Agents,2015,45(5):512-518.

[4]Stevens DL,Bisno AL,Chambers HF,et al.Executive Summary: Practice Guidelines for the Diagnosis and Management of Skin and Soft Tissue Infections:2014 Update by the Infectious Diseases Society of America[J].Clin Infect Dis,2014,59(2):147-159.

[5]Siva R,Bafadhel M,Monterio W,et al.Effect of levofloxacin on neutrophilic airway inflammation in stable COPD:a randomized, double-blind,placebo-controlled trial[J].Int J Chron Obstruct Pulmon Dis,2014,7(9):179-186.

[6]Lin HA,Yang YS,Wang JX,et al.Comparison of the effectiveness and antibiotic cost among ceftriaxone,ertapenem,and levofloxacin in treatment of community-acquired complicated urinary tract infections[J].J Microbiol Immunol Infect,2015.

[7]Selgrad M,Tammer I,Langner C,et al.Different antibiotic susceptibility between antrum and corpus of the stomach,a possible reason for treatment failure of Helicobacter pylori infection[J].World J Gastroenterol,2014,20(43):16245-16251.

[8]Aguilar-Carrasco JC,Hernández-Pineda J,Jiménez-AndradeJM,et al.Rapid and sensitive determination of levofloxacin in microsamples of human plasma by high-performance liquid chromatography and its application in a pharmacokinetic study[J].Biomed Chromatogr,2015,29(3):341-345.

[9]SACHAN N,CHANDRA P,YADAV M.Simple and Validated UVSpectrophotometric Method for the estimation of Levofloxacin in Bulk and Pharmaceutical Dosage forms[J].Int J of Pharma and Pharma,2012,4(5):383-385.

[10]Bottcher S,Baum HV,Hoppe-Tichy T,et al.An HPLC assay and a microbiological assay to determine levofloxacin in soft tissue, bone,bile and serum[J].J Pharm Biomed Anal,2001,25(2): 197-203.

[11]SombiéBC,Yameogo JG,Semdé R,et al.Ciprofloxacin monoolein water gels as implants for the treatment of chronic osteomyelitis: In vitro characterization[J].J Adv Pharm Technol Res,2014,5(4): 158-163.

[12]Jorge LS,Chueire AG,Rossit ARB.Osteomyelitis:a current challenge[J].Braz J Infect Dis,2010,14(3):310-315.

[13]Hurtado FK,Weber B,Derendorf H,et al.Population Pharmacokinetic Modeling of the Unbound Levofloxacin Concentrations in Rat Plasma and Prostate Tissue Measured by Microdialysis[J].Antimicrob Agents Chemother,2014,58(2):678-686.

[14]Chamseddin C,Jira TH.Comparison of the chromatographic behavior of levofloxacin,ciprofloxacin and moxifloxacin on various HPLC phases[J].Pharmazie,2011,66(4):244-248.

[15]Nguyen HA,Grellet J,Ba BB,et al.Simultaneous determination of levofloxacin,gatifloxacin and moxifloxacin in serum by liquid chromatography withcolumnswitching[J].J Chromatogr BAnalyt Technol Biomed Life Sci,2004,810(1):77-83.

[16]Neckel U,Joukhadar C,Frossard M,et al.Simultaneous determination of levofloxacin and ciprofloxacin in microdialysates and plasma by high-performance liquid chromatography[J].Analytica Chimica Acta,2002,463(2):199-206.

[17]Ji HY,Jeong DW,Kim YH,et al.Hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the determination of levofloxacin in human plasma[J].J Pharm Biomed Anal, 2006,41(2):622-627.

[18]國家藥典委員會編，中華人民共和國藥典[M].2部，北京中國醫藥科技出版社，2010版附錄Ⅳ，23-24.

[19]Langergraber G,Fleischmann N,Hofstaedter F.A multivariate calibration procedure for UV/VIS spectrometric quantification of organic matter and nitrate in wastewater[J].Water Sci Technol, 2003,47(2):63-71.

[20]Navneet K,Karan M,Rishabh N,et al.A sensitive spectrophotometric method for the determination of pregabalin in pure drug and pharmaceutical formulations through benzoylation[J].IRJP,2010,1 (1):175-180.

Comparison of bone repair materials composite nanospheres levofloxacin by HPLC with UV-VIS method

Wang Qi,Chen Cheng,He Xiaoqiang,et al.
Department of Orthopedics,the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing,400016,China

Objective Comparison of highperformanceliquidchromatography(HPLC)withUV-visiblespectrophotometer (UV-VIS)detect levofloxacin in nanoparticles.To establish a methodology for the evaluation of drug release from the bone repair material.Methods We use different concentrations of standard levofloxacin to establish a standard curve. Choose low,medium,high concentrations within the linear range,then calculate the recovery rate.A total of 10 drugloadedbone repairmaterial(10mm×6mm×6mm)were immersedin3mL SBFIndividually.All thematerialswere carried out for testing.The paired t-test was used to see if there are significant differences between the two results.Results The linear equations by HPLC method was:Y=0.0334X-0.01(r=0.9996),The calibrationcurve showed linearity over a concentrationrange from0.5to250 g/3mL;The linear equationsbyUV-VIS method was:Y=0.06588X+0.01669(r=0.9999), The calibration curve showed linearity over a concentration range from 0.5 to 50 g/3mL.Three different concentrations of sample recoveries by HPLC were(96.33±0.58)%,(111.00±0.00)%,(105.00±0.00)%，relative standard deviation were 0.37%,0.17%,0.06%;Three different concentrations of sample recoveries by UV-VIS were(96.00±2.00)%, (99.00±0.00)%,(98.66±0.00)%,relative standard deviation were 1.34%,0.00%,0.03%.The average concentration of HPLC method was(30.43±10.27) g/mL;The average concentration of UV-VIS method was(187.93±33.52) g/ mL.There was significant statistical difference between the results obtained by the two methods(=20.169,=0.000). Conclusion HPLC method was found to be specific,high recovery rate,high accuracy,HPLC method was an ideal method for the evaluation of drug release from the bone repair material.

Levofloxacin;Bone repair material;Nanoparticles;HPLC;UV-VIS

R681.21；R917.1

A

10.3969/j.issn.1672-5972.2016.06.08

swgk2015-12-00259

王琦（1989-）男，碩士，醫師。研究方向：人工骨修復材料，骨關節外科。

2015-12-22）

國家高技術研究發展計劃（863計劃）資助項目（編號：2013AA032203）；重慶市研究生科研創新基金資助項目（編號：CYS14121）

重慶醫科大學附屬第一醫院骨科，重慶400016