我國胃腸道腫瘤生物樣本庫建設與發展15年回顧*

于穎彥

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我國胃腸道腫瘤生物樣本庫建設與發展15年回顧*

于穎彥

摘要腫瘤生物樣本庫是轉化醫學研究與精準醫學研究的重要基礎設施，在歐美等國家倍受重視?？v觀我國胃腸道腫瘤生物樣本庫建設與發展走過的15年歷程，在樣本庫建設形式上經歷了最早的項目驅動性科室建設模式，發展到區域生物樣本庫網絡融合模式，再到即將納入國家重大基礎研究設施建設規劃模式。在樣本庫建設內容上，從最初僅收集患者外周血與腫瘤組織模式，至患者體液（血液與尿液）、組織及臨床病理學信息同步收集與信息化管理模式。高質量的腫瘤生物樣本是支撐我國胃腸道腫瘤研究領域開展國內或者國際重大合作研究項目的材料與信息資源保障。本文詳盡介紹了我國胃腸道腫瘤生物樣本庫建設15年來的經驗與存在問題，尤其對研究人員關心的長期低溫凍存腫瘤組織生物樣本的質量控制問題進行了介紹。

關鍵詞胃腸道腫瘤生物樣本庫質量控制

*本文課題受國家高技術研究發展計劃（863計劃）（編號：2012AA02A504，2012AA02A203）、國家自然科學基金項目（編號：81172329，81372644）、上海交通大學醫學院轉化醫學創新基金（編號：15ZH1002，15ZH4001）和上海交通大學醫學院“985”工程建設生物樣本建設基金資助

Retrospect of 15-year construction and progress of biobank for gastrointestinal cancer in China

Yingyan YU
Correspondence to: Yingyan YU; E-mail: ruijinhospitalyyy@163.com
Department of Surgery, Shanghai Ruijin Hospital, Shanghai Institute of Digestive Surgery, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China

This work was supported by the Chinese National High Tech Program (No. 2012AA02A504, 2012AA02A203), the National Natural Science Foundation of China (No. 81172329 and 81372644), the Innovation Foundation of Translational Medicine of Shanghai Jiaotong University School of Medicine (No. 15ZH1002 and 15ZH4001), and "985" Project of Biobank of Shanghai Jiaotong University School of Medicine

Abstract Tumor biobank is a critical infrastructure for translational medicine research and precise medical research, which has been paid increasing attention in Western countries. Three different periods exist throughout the course of the 15-year construction and progress of the gastrointestinal cancer biobank in China. The periods include the following: construction of a project-driven biobank, which is closely related to the division's project; formation of a regional network of biobanks, which integrates multiple biobanks with different kinds of diseases; and enrollment of the project to national key basic research facilities by the government. The constructioncontent of gastrointestinal cancer biobank has two stages: collection of peripheral blood and tumor tissues, patient body fluids (blood and urine), and tumor tissues; and information management of clinical and pathological details. The high-quality biospecimens safeguard the strong support of many domestic projects and international research projects. This review summarizes the experiences and problems of gastrointestinal tumor biobanks in China. The author introduces quality control problems for long-term cryopreserved biospecimens in deep freezer.

Keywords:gastrointestinal cancer, biobank, quality control

腫瘤生物樣本庫顧名思義就是為了醫藥研究的需要而收集、儲存和分配腫瘤樣本的機構。自20世紀末腫瘤轉化醫學研究理念提出以來，各國研究人員、臨床醫師以及藥物研發企業均十分重視生物樣本庫的建設。我國在該領域起步并不算晚，并且從“十一五”到“十二五”期間均得到了國家科技部以及地方政府資金的投入。鑒于腫瘤轉化醫學與精準醫學研究都需要高質量腫瘤生物樣本的支撐，筆者結合多年在胃腸道腫瘤生物樣本庫建設的實踐經驗，對該領域大家普遍關心的問題做一闡述。

1　國內外腫瘤生物樣本庫的形式

當前，國內外陸續建立了不少腫瘤樣本庫，形式多種多樣。有國家集約化管理的，如英國國家生物樣本庫（UK Biobank）與德國國家研究隊列（German National Cohort）［1-2］，也有各單位因科研項目需要自行建設的。依據筆者從事胃腸道腫瘤生物樣本庫建設與管理多年經驗和對國際大型生物樣本庫實地走訪所見所聞，一般集約化管理的生物樣本庫往往適用于僅收集血液或其他體液樣本，因為血液與體液樣本的收集具有便于集中采集、集中分裝、集中入庫儲存等優勢；而腫瘤組織樣本的采集與分裝很難實現集約化收集模式，更多的是依賴于外科手術醫師與病理取材醫師的參與和密切合作，才能實現在腫瘤手術切除后的離體短時間內（通常在30 min）獲取到新鮮腫瘤組織以及配套的正常對照樣本。眾所周知，國內外傳統醫療檔案中已經儲存了相當一部分腫瘤組織樣本，但這些樣本都是經過福爾馬林固定、石蠟包埋的組織塊，幾乎很難用這些組織進行現代基因組學、轉錄組學、蛋白質組學以及代謝組學等“組學”研究，建設腫瘤生物樣本庫的需求日益高漲，在此種情況下便逐步誕生了生物樣本庫。因此，腫瘤生物樣本庫建設是科學發展需求，更是時代發展需求的產物。

2　我國胃腸道腫瘤生物樣本庫發展的三階段模式

縱觀我國胃腸道腫瘤生物樣本庫發展歷程大致分成以下3個階段：1）項目驅動建設階段。即廣大臨床一線從事腫瘤的研究人員出于本單位或者本學科科研項目的需要，自發地收集新鮮腫瘤組織樣本階段。20世紀末至21世紀初，分子生物學不斷向臨床腫瘤研究領域滲透，一些檢測mRNA表達的PCR實驗、檢測蛋白質表達的Western blot實驗、檢測基因表達譜的基因芯片實驗等均需要新鮮組織樣本才能夠實現。在眾多科研項目驅動下，臨床研究人員特別是腫瘤外科界的研究人員紛紛建立起本學科的胃腸道腫瘤生物樣本庫。如北京大學腫瘤醫院以季加孚教授為首建立的胃腸道腫瘤生物樣本庫、上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院以朱正綱教授為首建立的胃腸道腫瘤生物樣本庫都是在那個年代應運而生，該階段經歷了10年左右［3-5］。胃腸道腫瘤生物樣本庫建設的初衷是希望在胃腸道腫瘤患者的血清或者組織中尋找新型診斷標志物以及藥物治療靶標，故一般的建設內容中均包括留取手術前患者的外周血，收集到的外周血應當在5 h內進行離心處理，然后分裝到低溫凍存管內低溫凍存；再將手術切除的樣本在離體30 min內切取部分正常黏膜組織和部分腫瘤組織，剪成小指甲片大小分裝到低溫凍存管內低溫凍存。近幾年為了便于后續開展尿液代謝組學研究，在胃腸道腫瘤生物樣本庫建設中有些生物樣本庫又增加收集患者術前中段尿液的內容，收集到的尿液同樣需要在5 h內進行離心分裝到凍存管內，然后置低溫冰箱凍存。在上述生物樣本儲存方面，患者體液樣本可以在-40℃至-80℃低溫冰箱保存，而胃腸道腫瘤組織樣本則務必在-80℃低溫冰箱保存，有條件的單位還應當考慮同時在液氮中保存部分腫瘤組織樣本。在胃腸道腫瘤生物樣本庫建設中務必同時收集詳盡的患者臨床病理學信息，并定期隨訪患者術后治療經過與臨床結局，做好生物樣本庫的信息化建設與管理。2）胃腸道腫瘤生物樣本庫整合到區域生物樣本庫網絡階段。隨著各個系統疾病研究對新鮮樣本的需求與日俱增，加之轉化醫學研究理念在國內日益受到重視，我國的腫瘤生物樣本庫建設逐步引起各級科研主管部門、生物醫藥相關企業或者行業協會的重視。國內逐步出現以單位行為或者行業協會形式發起組建的多學科生物樣本庫網絡，如上海腫瘤醫院多腫瘤生物樣本庫、上海交通大學醫學院“985”工程建設生物樣本庫網、中國醫藥生物技術協會生物樣本庫分會等。這一時期的腫瘤生物樣本庫不再是以單純滿足某一學科的自給自足為目的，而是更加強調生物樣本的共享、生物樣本對國家級或者國際性重大項目的貢獻、生物樣本收集的規范性、生物樣本庫數據的信息化管理程度等。如郜恒駿教授組織的中國醫藥生物技術協會生物樣本庫分會不僅召開樣本庫建設學術交流會議，還著手制定生物樣本收集標準流程（SOP）并在會員單位普及推廣［6］；呂有勇教授負責的國家“863”《胃癌分子分型與個體化診療》項目制定了各參與單位統一的生物樣本收集與臨床病理學信息收集規范［7］；上海交通大學醫學院資助旗下數家大型附屬醫院建立多病種生物樣本庫，并推進實現了樣本庫的信息化建設與網絡化管理。經過大約5年的樣本庫區域網絡化建設，加之前10年左右的生物樣本庫基礎性建設，不僅是胃腸道腫瘤生物樣本庫，我國整體腫瘤生物樣本庫及相應的臨床病理學信息建設均得到長足的發展，對我國腫瘤基因組研究較早地跨入國際第一方陣起到了決定性作用。通過文獻檢索不難發現，自2010年至2015年期間，我國腫瘤界科研人員在國際刊物上連續發表腫瘤基因組研究相關成果，并代表中國參與了國際癌癥基因組聯盟（ICGC）重大國際項目就是最好的見證［8-18］。3）生物樣本庫建設納入國家重大基礎研究設施階段。進入2015年，醫學研究由轉化醫學研究跨入精準醫學研究時代，國家科技主管部門意識到腫瘤生物樣本庫已經不是可有可無的附屬設施，應當作為國家重大基礎研究設施加以建設。以上海瑞金醫院正在籌建的轉化醫學（上海）國家重大科技基礎設施為例，預計完工后將包含一個國際一流的大型多病種生物樣本庫［19］?？梢灶A見，未來的精準醫學研究以及轉化醫學研究對高質量的生物樣本的需求會越來越大。

3　腫瘤生物樣本庫發展過程中遇到的問題

胃腸道腫瘤生物樣本庫的建設與發展走過的15年是我國實體瘤生物樣本庫建設的縮影。經過15年的建設，低溫凍存的腫瘤生物樣本數量不斷增加。15年來，廣大腫瘤研究人員靠著這批高質量生物樣本產出了一批高質量的研究成果，腫瘤生物樣本庫支撐了多項國家級與國際性重大研究項目。但隨著時間推移，人們不免會產生如下擔憂：腫瘤生物樣本在低溫儲存下究竟能夠存放多少年；各種“組學”研究需要的核糖核酸或者蛋白質大分子是否會因低溫保存時間太長而影響檢測結果；生物樣本是需要無限制地儲存下去，還是存儲到一定年限即行銷毀。這些都是擺在生物樣本庫建設者、管理者與樣本使用者面前的實際問題。這些問題不是哪位權威、專家、樣本庫管理者可以決定，而是需要切實的生物樣本質量控制研究數據來回答。筆者所在單位是國內最早開始收集胃腸道腫瘤生物樣本的單位之一，筆者參與了大量工作，可以說比任何人都想知道以上問題的答案。本研究組曾經在生物樣本收集滿5年時隨機抽取過一批胃癌組織樣本進行核酸與蛋白質的質量分析。由于受到樣本庫管理經驗、生物樣本檢測方法學技術的發展等多因素制約，當時僅用BCA法測定了蛋白濃度，用凝膠電泳法鑒定了RNA 與DNA的完整性，并針對原癌基因NF-κB檢測了單核苷酸多態性（SNP）的位點變異、mRNA與蛋白質的表達水平。通過前期對低溫凍存5年以內胃癌樣本的質量檢測，我們初步斷定，低溫凍存5年的樣本其DNA分子完整性與質量均未受影響；儲存3年或以上的標本與保存1～2年者相比，NF-κB基因的mRNA表達及蛋白質表達均有所下調［20］。如今隨著歲月推移，不少生物樣本庫中的樣本儲存已達10年或者更久，在此期間，分子生物學界對生物大分子質量檢測的方法學有了長足的發展，適時的將這些分析方法應用于胃腸道腫瘤生物樣本庫的質量控制研究，將有助于回答人們對生物樣本質量所關注的諸多問題。在胃腸道腫瘤分子生物學研究中，科研人員最為關注的就是DNA、RNA與蛋白質的質量是否可以確保實驗順利實施?，F根據國內外生物大分子質量檢測技術的發展與本實驗室經驗做一系統性介紹。

3.1低溫凍存樣本的DNA質量評估

DNA是生物大分子中最為穩定的分子，往往可以耐受長時間的儲存甚至高溫處理，有些年代久遠的考古樣本鑒定都是通過DNA分子進行的。生物樣本的DNA質量控制分析時除了關注分子完整性外（1%凝膠電泳中的DNA條帶是否明亮清晰），還要關注OD260/OD280的吸光度比值。OD260代表核酸DNA的吸光度，OD280代表蛋白質的吸光度。植物樣本分析，還要關注OD230值（代表多糖類），但由于人類組織多糖類殘留的可能性比較低，故可以不去關注OD230值。純凈的DNA其OD260/OD280≈1.8，若比值>1.9表明有RNA污染，根據情況可考慮用RNA酶進行純化；若OD260/OD280比值<1.6，表明有蛋白質或酚等試劑污染，也可根據情況進行相應的純化。

3.2低溫凍存樣本的RNA質量評估

RNA是生物大分子中穩定性較差的分子，比較容易降解。分子生物學實驗需要明確生物樣本RNA分子的完整性。以往對于RNA的質量控制分析一直沿用1%凝膠電泳中觀察RNA條帶，通過觀察瓊脂糖凝膠電泳圖的28S與18S核糖體RNA（rRNA）條帶的存在與否與條帶亮度，計算28S和18S rRNA條帶的比值，當比值為2則認為RNA分子完整［21-23］。自從安捷倫公司開發出生物分析儀后（Agilent 2100生物分析儀），人們很快注意到，借助于安捷倫生物分析儀不僅可以得到規范清晰的色譜圖像，便于觀察28S與18S RNA的分布情況，最為有用的是，該儀器自帶分析軟件（RIN software algorithm）可以給出檢測樣本的RNA完整性數值（RNA integrity number，RIN）。RIN采用1～10的數字表示，完整RNA分子的RIN為10。根據已經發表的對生物樣本質量評估報道來看，RIN值高于7可以視為RNA分子質量優秀，適用于較高級別的RNA研究，如基因芯片檢測；RIN值為4~7視為RNA分子質量良好，可用于一般級別的定量PCR研究；當RIN值在4以下或者接近1時提示RNA分子降解嚴重，已經不適合進行RNA水平的研究［24］。安捷倫生物分析儀問世以來，以其獨特的優勢受到業界廣泛關注與好評。然而，由于該檢測設備較為昂貴，目前主要在大型基因芯片檢測公司或者測序公司有配備，尚未在一般實驗室普及。

3.3低溫凍存樣本的蛋白質質量評估

蛋白質是基因表達的終產物，其分子的穩定性眾說紛紜。以往均認為蛋白質需要低溫保存，加熱可導致蛋白質不可逆性變性而失去原有的抗原性。但20世紀90年代以來，一種微波加熱修復抗原技術（antigen retrieval）問世，該項技術可以使保存數十年之久的石蠟包埋組織蛋白質抗原性得以恢復，再通過免疫組織化學技術實現蛋白質表達的檢測。該項技術的基本原理是利用高溫或者強堿打開甲醛與蛋白質之間的交聯結構，實現組織蛋白質的暴露與檢測［25］。伴隨著這一免疫組織化學技術的革命性突破，對蛋白質分子的穩定性與抗原性也應當重新思考。雖然免疫組織化學工作者未對抗原修復的具體機制、熱修復前后的蛋白質結構給予更加深入細致的研究，但這一不爭的事實至少可以提醒科研人員，蛋白質具有極強的耐熱能力，高溫加熱處理并未消除蛋白質的抗原性。最近，科研人員不斷探索利用福爾馬林固定、石蠟包埋的組織塊提取蛋白質進行蛋白質組學研究甚至進行Western blot分析。從現有發表的研究結果看，在腫瘤研究領域已經發現了差異蛋白質譜，但差異蛋白分子量往往在50 kD以下［26］，這些成果已經為今后研究人員針對醫療檔案中豐富的石蠟包埋組織塊提供了良好的參考。目前，對組織樣本庫中或者石蠟包埋組織塊中的蛋白質分子進行質量評估還需要開展系統性研究。能夠從文獻檢索到的生物樣本質量評估文章大多限于DNA與RNA層面。一般實驗室采用BCA法檢測樣本的蛋白含量，但無法評估蛋白質分子的完整性。最近，本實驗室在與北京大學腫瘤醫院開展學術探討以及查閱文獻中受到啟發，開始探索將考馬斯亮藍染色法（coo? massie brilliant blue，CBB）引入蛋白質分子的完整性評估。CBB法利用了蛋白質具有與染料結合的能力，不僅可以定量測定蛋白的濃度，還能夠在染料染色后的聚丙烯酰胺凝膠上顯示清晰的不同分子量蛋白質條帶［27-30］?？捡R斯亮藍G-250染料在酸性溶液中能夠與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰由465 nm變為595 nm，染色溶液由棕黑色變為藍色。通過測定595 nm處吸光度值可測定其結合蛋白質的含量，CBB法在一些實驗室也用來進行蛋白質定量檢測［30］。鑒于CBB法是根據凝膠上清晰顯示蛋白質條帶這一特性，同樣可以將其用于蛋白質分子的完整性評判?；谶@一原理，本研究室最近已經將CBB法用于胃癌生物樣本的蛋白質完整性評估并取得了預期成果。我們發現，隨著低溫凍存時間延長，在CBB凝膠染色檢測中蛋白質條帶數目減少、條帶清晰度以及大分子量條帶數目明顯減少甚至消失。相信這些探索性的研究發現對胃腸道腫瘤生物樣本庫建設、對其他實體瘤生物樣本庫的建立與管理均會起到重要借鑒作用。

4　展望

在精準醫學時代，腫瘤生物樣本的作用越發重要。鑒于人群的生物多樣性，今后生物樣本庫建設可能會從重視樣本的數量轉向生物樣本的多樣性，暨收集到的樣本類型應當更加廣泛與多樣。在生物樣本儲存條件上將更加強調安全性，如是否有斷電保護措施、是否具備防火防洪措施、珍稀樣本的第三方儲存機制可能會得到考慮。此外，大型研究項目與企業藥物研發等對高質量生物樣本的需求增加，生物樣本與信息的共享機制將會提到議事日程。由于國內各大型樣本庫前期均是由國家或者地方政府項目基金支持所建，生物樣本收集與管理人員投入了大量的人力與物力，對于第三方或者有贏利性質的企業希望樣本共享目前尚難以實現。因此，生物樣本庫建設方與使用方需要通過商談建立各方均可接受的生物樣本與臨床病理學信息共享機制。如簽署共同署名或者共同持有知識產權協議、企業以研究立項形式對生物樣本庫建設方給予資金上的投入與支持等。最為重要的是，由于生物樣本的稀有性與不可復制性，低溫凍存并非是一勞永逸之舉，考慮到生物大分子的完整性會隨著時間推移而受到破壞，故如何有組織、有規劃、有目的地充分利用現有生物樣本庫庫存樣本，以期最大化產出推動精準醫療發展的研究成果至關重要。

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（2015-11-30收稿）

（2015-12-22修回）

（編輯：邢穎）

·專家論壇·

梁寒，教授，主任醫師，現任天津醫科大學腫瘤醫院胃部腫瘤科科主任。中國抗癌協會理事，天津抗癌協會理事，中國醫師協會腫瘤外科分會副主任委員，中國抗癌協會胃癌專業委員會副主任委員，中華醫學會腫瘤學會胃腸學組副組長，中國臨床腫瘤學會中國腫瘤驅動基因分析聯盟（CAGC）執行委員會常委，中國研究型醫院消化道腫瘤專業委員會常委，中國臨床腫瘤學會胃腸道間質瘤專家委員會委員，衛生部全國腫瘤規范化診治專家委員會委員，天津市抗癌協會胃癌專業委員會主任委員，天津市中西醫結合外科學會副主任委員，《Journal Gastroenterology and Hepatology》、《中華胃腸外科雜志》、《中國腫瘤臨床》、《中華腫瘤防治雜志》、《消化腫瘤雜志》、《中國普外基礎與臨床雜志》編委。出版專著6部，發表論文300余篇，其中SCI收錄論文50余篇。

通信作者：于穎彥ruijinhospitalyyy@163.com

doi:10.3969/j.issn.1000-8179.2016.01.075

作者單位：上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院上海消化外科研究所，上海市胃腫瘤診治重點實驗室（上海市200025）