深低溫凍存胃癌樣本的核酸與蛋白質質量控制研究*

張佳年　計駿　劉炳亞　朱正綱　傅國輝　于穎彥

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深低溫凍存胃癌樣本的核酸與蛋白質質量控制研究*

張佳年①②計駿②劉炳亞②朱正綱②傅國輝①于穎彥②

摘要目的：探索上海市瑞金醫院低溫凍存0~10年胃癌樣本的核酸與蛋白質質量。方法：隨機抽取2003年至2014年間庫存手術切除胃癌標本24對（共48份）。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA與RNA純度及完整性，同時增加了RIN值評估法檢測RNA完整性；BCA法檢測樣本蛋白質濃度，考馬斯亮藍法測定蛋白質分子完整性。結果：將組織標本按凍存年限分成四組（<2年、3～5年、6～8年和>9年），各組之間DNA完整性差異無統計學意義（P>0.05），正常胃組織的DNA降解程度比胃癌組織高（P=0.023）；四組之間的RIN值檢測顯示，凍存6年以上組的RIN值有明顯下降（P=0.018）；各組間的蛋白質濃度無顯著性差異，考馬斯亮藍法測定蛋白質分子條帶完整性存在顯著性差異。凍存>9年組僅出現少量低分子量條帶（平均36.5 kD），凍存6～8年組尚有中等分子量（平均65.63 kD）條帶，凍存3～5年組有高分子量（平均127.5 kD）條帶，凍存短于2年組仍可見大分子量（平均160 kD）條帶。結論：長期低溫凍存對DNA影響最小，超過5年組RNA和大分子量蛋白質降解較多，但中小分子量蛋白質保存完好。

關鍵詞生物樣本胃癌低溫保存核酸蛋白質質量控制

*本文課題受國家高技術研究發展計劃“863”項目（編號：2012AA02A504，2012AA02A203）、國家自然科學基金項目（編號：81172329，81372644）、上海交通大學醫學院轉化醫學創新基金（編號：15ZH1002，15ZH4001）和“985”生物樣本庫建設基金資助

Quality control of nucleic acids and protein of freeze-preserving gastric cancer samples

Jianian ZHANG1,2, Jun JI2, Bingya LIU2, Zhenggang ZHU2, Guohui FU1, Yingyan YU2
Correspondence to: Yingyan YU, E-mail: ruijinhospitalyyy@163.com; Guohui FU, E-mail: fuguhu@263.net
1Department of Pathology, Basic Medical College, Shanghai Jiao Tong University;2School of Medicine and Shanghai Ruijin Hospital, Shanghai Institute of Digestive Surgery, the Key Laboratory of Gastric Tumor of Shanghai City, Shanghai 200025, China

This work was supported by the Chinese National High Tech Program (No. 2012AA02A504 and 2012AA02A203), National Natural Science Foundation of China (No. 81172329 and 81372644), Innovation Foundation of Translational Medicine of Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (No. 15ZH1002 and 15ZH4001), and Project of Biobank of Gastrointestinal Carcinoma of Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

Abstract Objective: To explore the quality of inventory samples of a biobank stored in a deep freezer from 0 to over 10 years in Shanghai Ruijin Hospital. Methods: We extracted 24 pairs of stocked gastric cancer samples between 2003 and 2014. We used 1% agarose gel electrophoresis to analyze DNA and RNA purity and integrity while adding the RNA integrity number (RIN) for precise analysis. Bicinchonininc acid (BCA) assay was used for protein concentration evaluation. Coomassie brilliant blue method was used for protein integrity assay. Results: The samples were divided into four groups according to cryopreservation period (<2 years, 3-5 years, 6-8 years, and >9 years). No significant difference in DNA integrity was found between the groups (P>0.05); however, DNA degradation in normal gastric mucosa was faster than that in gastric cancer tissue (P=0.023). The RIN significantly declined when the storage period was 6 years or longer (P=0.018). No significant difference in protein concentration was observed between different groups. Using Coomassie brilliant blue method, we found significant differences in preserved proteins with different molecular weights. Proteins with varying molecular weights were detected in the groups with the following cryopreservation periods: >9 years, a small number of lowmolecular-weight (average 36.5 KD) proteins; 6-8 years, medium-molecular-weight (average 65.63KD) proteins; 3-5 years, high-molecular-weight (average 127.5 KD) proteins; <2 years, high-molecular-weight (average 160 KD) proteins. Conclusion: Cryopreservation does not exert an obvious effect on DNA. If the cryopreservation period is more than 5 years, serious degradation of RNA should occur; likewise, degradation of proteins with higher molecular weight should occur.

Keywords:biosample, gastric cancer, cryo preservation, nucleic acid, protein, quality control

腫瘤分子生物學與轉化醫學研究對高質量新鮮腫瘤標本的需求日益增長，生物樣本庫建設是后基因組時代的重要課題。腫瘤生物樣本收集從既往根據課題研究需要臨時收集轉向專業性、規模性收集。腫瘤生物樣本庫建設始于20世紀90年代后期。目前，美國、英國、法國、德國、意大利和澳大利亞等國家的研究機構建立有較為完善的腫瘤生物標本庫［1-5］，不僅為腫瘤基礎與臨床研究提供重要的標本，并在核酸與蛋白質的提取、分析和建立腫瘤細胞系方面取得成果［6-8］。中國腫瘤生物樣本庫建設已有十余年歷史，近年來又成立了全國范圍內的生物樣本庫協會。北京大學臨床腫瘤學院較早地建立了腫瘤標本庫，較好地促進了胃腸道腫瘤基礎研究與靶向治療研究［9］。上海市瑞金醫院自2001年起開展胃腸道腫瘤生物樣本庫建設［10］，并注重低溫凍存生物樣本質量控制。如在腫瘤樣本保存滿5年時進行過隨機樣本的生物大分子質量控制研究［11］。目前，有較大比例生物樣本保存時間已經長達10年之久。為分析長期冷凍保存腫瘤樣本是否適合分子生物學實驗，本文探討了低溫樣本庫的儲存年限與核酸和蛋白質的分子完整性關系，以期為高質量生物樣本庫建設以及腫瘤轉化醫學研究提供參考。

1　材料與方法

1.1胃癌樣本

隨機抽取上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院胃腸腫瘤樣本庫中2003年至2014年間庫存手術切除胃癌標本24對，共48份。所有樣本均為胃腸外科資深醫師行胃癌根治術切取的胃癌標本，標本離體后30 min內取材、分裝在低溫凍存管后投于液氮內，然后轉入-80℃深低溫冰箱保存。低溫凍存時間在數月至10年以上不等。樣本編號N代表正常胃組織，T代表胃癌組織。所有患者術前均未接受放化療。標本編號與儲存時間的對應關系見表1。

1.2樣本中腫瘤細胞含量評估

本樣本庫所有組織均同時留存一份于10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋后制備組織切片，由專職病理醫師進行腫瘤組織學分類以及腫瘤細胞含量評估，本研究所有樣本的腫瘤細胞含量均大于60%。

1.3核酸抽提與質控

DNA抽提使用QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen，Hilden，德國）。利用分光光度計（賽默飛Nano?Drop2000，美國）測定A260/A280比值。1%瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA條帶完整性：DNA樣本上樣量為5 μL，電泳時間為30 min，于凝膠圖像分析儀（Fluor-STM Multimanger，BIO-RAD，美國）觀察電泳條帶。RNA抽提采用Trizol（Invitrogen，CA，美國）抽提法。分光光度計測定A260/A280比值，1%瓊脂糖凝膠電泳測量28S和18S核糖體RNA條帶。RNA上樣量為4 μL，電泳時間30 min，于凝膠圖像分析儀觀察電泳條帶；Ag?ilent 2100生物分析儀（Agilent，CA，美國）測量RNA完整數值（RNA integrity number，RIN）［12-13］。

1.4蛋白質抽提與質控

采用哺乳動物總蛋白提取試劑盒M-PER?（Pierce，美國）抽提蛋白質。BCA法（Pierce，美國）測蛋白質濃度（3 μL蛋白質與227 μL BCA工作液混勻，37℃孵育30 min后于572 nm檢測其A值）?？捡R斯亮藍（Coomassie brilliant blue，SIGMA公司，美國）法測定蛋白質分子完整性［14］。各組蛋白質樣本30 μg 于12.5%聚丙烯凝膠電泳2 h，然后取下整塊凝膠于固定液中固定1 h（固定液：用水配成10 mL溶液中含40%甲醇、10%乙酸）后染色30 min（染色液：濃度0.5%，0.5 g考馬斯亮藍粉劑+100 mL脫色液）；最后置于脫色液中多次脫色直至肉眼可見清晰條帶（脫色液：用水配成10 mL溶液，含30%甲醇、10%乙酸）。

1.5統計學方法

所有實驗數據應用SPSS 13.0統計軟件分析。DNA的A260/A280比值、RNA的A260/A280比值、RIN值采用單向ANOVA檢驗，蛋白質濃度、考馬斯亮藍染色條帶數采用配對ANOVA檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1 DNA分子完整性及質量分級

采用1%瓊脂糖凝膠電泳圖分析胃癌樣本DNA完整性得到圖1。該圖DNA樣本完整性主要觀察高分子量位置上的DNA分子條帶亮度與有無拖尾出現。若條帶清晰、明亮、無拖尾，將其歸為質量A級；有清晰條帶，但有一定的拖尾，將其歸為質量B級；無明確條帶而是在泳道上呈現彌散帶狀，將其歸為質量C級。本組樣本DNA分子的質控檢測與儲存年限關系見表2?？梢?，長期低溫凍存對組織樣本DNA質量有一定影響，其中對正常胃組織樣本（N）的影響明顯大于對胃癌組織樣本（T）的影響，正常胃組織A、B、C級別樣本數目與胃癌組織A、B、C級別樣本數目之比為8：14：2 vs. 17：5：2（P=0.023）。本研究組將組織標本按年限分成四組，分別為<2年、3～5年、6～8年、>9年，各個年限A、B、C級樣本數目之比為7：3：2、4：6：2、9：3：0和5：7：0，經統計學分析未見顯著性差異（P>0.05）。

2.2 RNA分子完整性及質量分級

圖1　1%凝膠電泳檢測DNA分子完整性質量分級Figure 1 Presentation of DNA integrity analysis by 1% gel electrophoresis

既往分析樣本RNA質量與完整性主要參照在1%瓊脂糖凝膠電泳圖上28S與18S條帶情況。如在1%瓊脂糖凝膠電泳圖上有清晰的28S與18S兩條主帶則定義為A，若能看到兩個條帶但清晰度下降且28S條帶模糊定義為B，若28S與18S兩個條帶均消失呈涂抹狀則定義為C。自Agilent 2100生物分析儀問世后則可以根據RIN判斷RNA分子完整性。在Agi?lent 2100生物分析儀檢測的RIN值評價中，RIN>7表示質量好；RIN為4～7表示質量較好；RIN<4表示有嚴重的RNA降解。圖2是樣本中RNA的1%凝膠電泳檢測圖與RIN值檢測圖示。本組樣本的RNA分子的質控結果與儲存年限關系見表3。

表2　凍存樣本的DNA質控分級與儲存年限關系Table 2 Association of DNA quality grading with cryopreservation periods

表2　凍存樣本的DNA質控分級與儲存年限關系（續表2）Table 2 Association of DNA quality grading with cryopreservation periods

圖2　RNA分子完整性檢測Figure 2 Examination of RNA integnity

表3　凍存樣本的RNA質控分級與儲存年限關系（依據RIN值）Table 3 Association of RNA quality grading (RIN) with cryopreservation periods

表3　凍存樣本的RNA質控分級與儲存年限關系（依據RIN值）（續表3）Table 3 Association of RNA quality grading (RIN) with cryopreservation periods

將組織標本按年限分成四組，分別為<2年、3～5年、6～8年、>9年，統計分析了四組間A260/A280差異，結果示無顯著性差異（圖3A，P=0.13）。比較了四組之間RIN值差異，結果顯示，當樣本低溫凍存>9年后，其RIN值較6～8年組（P<0.05）和<2年組有明顯下降（P<0.05，圖3B）；且6～8年組較<2年組也有明顯下降（P=0.018）。提示凍存時間超過5年的標本RNA存在嚴重的降解。

2.3蛋白質分子完整性及質量分級

首先采用BCA法檢測了不同低溫保存年限的蛋白濃度（μg/μL）。將組織標本按照低溫凍存年限分成4組，分別為<2年、3～5年、6～8年和>9年，4組的蛋白質濃度無顯著性差異（圖4，P=0.483 5）。

將樣本按照凍存年限分成4組，考馬斯亮藍染色檢測低溫凍存<2年、3～5年、6～8年和>9年樣本的蛋白質完整性，及各樣本中不同分子量的蛋白質條帶（圖5）。由圖5A可以看出，當組織樣本低溫凍存> 9年時，電泳圖上幾乎無任何分子量的清晰條帶，各泳道均呈涂抹狀；低溫凍存6～8年的組織樣本在72 kD以下尚可見電泳條帶，而72 kD以上條帶已經消失，肉眼平均可見電泳條帶數為3條。在低溫凍存3～5年組和<2年組的電泳圖中，肉眼可見電泳條帶平均為5條，顯著多于凍存>6年組（P<0.05，圖5B）。通過與分子量指示劑對比分析，凍存>9年組僅在低分子量處依稀可辨少量條帶（平均36.5 kD），凍存時間6～8年組在中等分子量處可見條帶（平均65.63 kD），凍存時間3～5年組在高分子量處仍可見條帶（平均127.5 kD），凍存時間<2年組在最大分子量指示劑處仍可見條帶（平均160 kD）。經統計學分析，各組織間具有顯著性差異（P<0.05），但凍存3～5年組與<2年組之間未見顯著性差異（P=0.24，圖5C）。然而，在凍存3～5年組有一部分樣本在170 kD處缺乏條帶顯示，說明存在大分子量蛋白質的降解。將低溫凍存正常胃組織或者胃癌組織的蛋白質質量也分成三個等級：A級：電泳條帶從低分子量至高分子量均清晰可見；B級：電泳條圖上缺乏高分子量條帶，但中小分子條帶依然有部分清晰可見；C級：電泳圖上幾乎無可見清晰電泳條帶，各泳道均呈涂抹狀。本組不同保存年限與蛋白質質量關系見表4。

圖3　不同凍存有限樣本RNA質量比較Figure 3 Dffferenes of RNAquality in samples with different frozen periods

圖4　不同凍存年限樣本的蛋白質濃度比較Figure 4 No significant difference in protein concentration between different cryopreservation periods (P=0.4835)

圖5　不同凍存年限樣本的蛋白質完整性分析Figure 5 Protein integrity analysis of samples with different cryopreservation periods

表4　凍存樣本的蛋白質質控分級與儲存年限關系Table 4 Association of protein quality grade with cryopreservation periods

表4　凍存樣本的蛋白質質控分級與儲存年限關系（續表4）Table 4 Association of protein quality grade with cryopreservation periods

3　討論

腫瘤生物樣本庫的核心是溫度與質量，國際上在樣本核酸質量分析中，A260、A280及其比值是判斷DNA與RNA樣本純度的指標；電泳法檢測DNA完整性；RNA的完整性可用瓊脂糖凝膠電泳測量28S和18S核糖體RNA（rRNA）條帶法和RIN值檢測法。A260代表核酸（DNA，RNA）吸光度，A280代表蛋白質吸光度，在植物樣本分析中還會關注A230值（代表多糖類吸光度）。人類組織樣本由于多糖類殘留的可能性比較低，故可以不去關注A230值。純凈的DNA其A260/ A280≈1.8，比值在1.8～1.9為優秀，>1.9表明有RNA污染，可考慮用RNA酶純化樣本；當A260/A280比值為1.6～1.8之間為良好，比值＜1.6表明有蛋白質或酚等的污染［15］。純凈的RNA其A260/A280比值為1.7～2.0，比值<1.7表明有蛋白質或酚類污染，比值>2.0表明可能有異硫氰酸胍殘留。對于RNA完整性的評價目前主要有兩種方法，包括瓊脂糖凝膠電泳測量28S 和18S核糖體RNA（rRNA）條帶法和RIN值檢測法。rRNA占整個RNA分子的80%，而mRNA僅占RNA分子的3%，故檢測mRNA并不容易，而檢測含量高的rRNA相對容易。在瓊脂糖凝膠電泳中，當28S和18S 的rRNA條帶亮度比例為2時便被認為RNA完整。RNA是極易降解的生物分子，由于缺血、凋亡及壞死等影響，28S的rRNA比18S的rRNA更易退化，所以28S和18S的比值為2難以實現。RIN的計算采用了“RIN軟件算法”，檢測結果以1到10數字表示，完整的RNA為10。根據現有實驗報道，RIN值>7可視為優秀，適用于高質量的RNA研究，如基因芯片檢測；RIN值為4～7視為良好，可以用于一般分子生物學研究，如定量PCR；當RNA完全降解時RIN值為1。自RIN檢測方法開發以來，被廣泛用來評價RNA完整性。有文獻提出，對于有一定程度RNA降解的樣本，也可以進行定量PCR檢測獲得目的基因的相對表達量，從而提高了一批珍稀樣本利用率。有關RNA分子的穩定性尚有爭議，如有研究人員在室溫下切除離體組織檢測RNA質量，發現室溫下長達3～5 h RNA依然完整［16-17］。本研究僅對胃及胃癌組織進行了評估，尚不能反映全身組織情況。

以往對于生物樣本庫樣本的質量評估均圍繞DNA與RNA進行，少見有蛋白質質量評估的報道。參考了Ku等［18］研究報道，將考馬斯亮藍染色法引入蛋白質完整性評估中?？捡R斯亮藍法是利用蛋白質與染料結合的原理，可以實現定量蛋白濃度的方法，被認為是目前靈敏度最高的蛋白質測定法［19-20］?？捡R斯亮蘭G-250染料在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰的位置由465 nm變為595 nm，溶液的顏色由棕黑色變為蘭色。通過測定595 nm處光吸收的增加量可知結合的蛋白質量。已知染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸（如精氨酸）和芳香族氨相結合。通過本文探索性研究，可以清晰地獲得不同凍存時間組織標本的蛋白質電泳條帶數目與電泳條帶分子量差異。表明考馬斯亮藍法染色檢測聚丙烯凝膠蛋白質電泳條帶是一種方便可行的蛋白質質量評估方法。根據本次對于生物樣本庫評估結果，建議將樣本的蛋白質質量也分成三個等級。A級：各種分子量蛋白質保存完好，適合多種蛋白質實驗研究；B級：大分子量蛋白質已有降解，但中低分子量蛋白質尚保存，可以滿足部分蛋白質實驗研究需求（用戶可根據目的蛋白分子量決定）；C級：無論大小分子量蛋白質均有降解，無法滿足蛋白質研究的基本需求。以胃腸腫瘤生物樣本庫為例，保存<5年的樣本仍可進行蛋白質實驗研究，凍存>6年的樣本由于大分子量的蛋白質降解明顯，只適合根據候選基因編碼蛋白的分子量選擇性進行Western blot或者ELISA等實驗研究。

由于本研究組主要從事胃癌組織樣本庫建設，故本文的質控研究僅圍繞胃癌樣本展開，缺乏其他實體瘤生物樣本的長期保存質控研究數據，有關內容還有待國內外同道積累并報道更多的經驗。

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（2015-09-28收稿）

（2015-12-23修回）

（編輯：鄭莉）

張佳年專業方向為胃腸腫瘤生物樣本庫建設與分子病理學實驗研究。

E-mail：happynian@hotmail.com

·臨床研究與應用·

步召德，北京大學腫瘤醫院胃腸腫瘤中心主任醫師，二病區主任；外科教研室副主任；《Chinese Journal of Cancer Research》英文期刊編輯部主任。從事胃腸腫瘤的臨床和科研工作。積極參與消化道腫瘤治療的眾多新領域：早期胃癌的縮小手術、胃癌的新輔助化療和規范化手術、胃腸腫瘤的個體化治療。參與了國家“863”項目、國家自然科學基金項目、北京市科委項目等多項重大課題的研究，參加腫瘤組織標本庫的建設。發表多篇科研論文，作為主編或副主編出版了《癌癥治療新方法》、《普通外科疾病診治思路》、《腫瘤組織標本庫常用技術手冊》、《Bethesda臨床腫瘤學手冊》等專著或譯著。

作者簡介

通信作者：于穎彥ruijinhospitalyyy@163.com,傅國輝fuguhu@263.net

doi:10.3969/j.issn.1000-8179.2016.01.077

作者單位：①上海交通大學基礎醫學院病理教研室（上海市200025）；②上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院消化外科研究所，上海市胃腫瘤重點實驗室