金屬離子對4-氨基安替比林與牛血清白蛋白相互作用的影響

高宗華，付彩霞，王　雪，張懷斌

(濱州醫學院藥學院，山東煙臺264003)

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金屬離子對4-氨基安替比林與牛血清白蛋白相互作用的影響

高宗華*，付彩霞，王雪，張懷斌

(濱州醫學院藥學院，山東煙臺264003)

摘要:采用熒光法研究了金屬離子Ca2+、Zn2+和Mg2+存在下4-氨基安替比林( 4-AAP)與牛血清白蛋白( BSA)的相互作用．結果表明，金屬離子存在時，4-AAP對BSA的猝滅常數減小，但猝滅機制仍舊為靜態猝滅，4-AAP 與BSA之間的結合常數( KA)及結合位點數( n)均增大，分析認為，金屬離子在二者的結合作用中起了“離子架橋”的作用．

關鍵詞:4-氨基安替比林;牛血清白蛋白;相互作用;金屬離子

4-AAP作為原料中間體，被用于生產鎮痛、消炎、抗菌類的新型藥物［1］．血清白蛋白是生物體內血漿中含量最豐富的蛋白質，對生命活動有著非常重要的作用，是運輸內源及外源性物質的重要載體［2］．動物體的正常生理活動需要大量金屬離子的參與，我們在前期的研究中發現金屬離子對藥物小分子和蛋白質的作用會產生不同的影響［3－4］．鑒于此，本文作者在模擬生理條件下，用熒光光譜法研究了鈣、鎂、鋅3種金屬離子對4-AAP與BSA相互作用的影響，以期為4-AAP在體內的轉運、代謝等研究提供一定的參考信息．

1　實驗部分

1．1儀器與試劑

LS-55熒光分光光度計(美國，PE公司)，TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計(北京普析儀器公司)，電熱恒溫水浴鍋(龍口市先科儀器公司)，BP211D電子分析天平(上海精密儀器廠)．BSA(生化試劑，純度＞98%)，4-AAP購自國藥集團，為分析純，氯化鈉、Tris試劑、鹽酸、氯化鋅、氯化鈣、氯化鎂均為分析純．用0．05 mol·L－1pH= 7．40的Tris-HCl緩沖溶液(含0．1 mol·L－1NaCl)配制BSA溶液，BSA濃度為1．0×10－6mol·L－1，用蒸餾水配制濃度為1．16×10－3mol·L－1的4-AAP儲備液;配制濃度分別為1．00×10－4mol·L－1的ZnCl2、MgCl2、CaCl2溶液．實驗用水為二次蒸餾水．

1．2熒光光譜測定方法

292 K時，移取3．0 mL BSA溶液于石英比色皿中，逐次加入10 uL的4-AAP溶液，搖勻，靜置5 min．設定激發波長為280 nm，測定體系的熒光光譜，記錄最大發射波長處的熒光強度．

分別移取1．5 mL的BSA和1．5 mL的各種金屬離子(混合后BSA的濃度為5．00×10－7mol·L－1;各種金屬離子的濃度為5．00×10－5mol·L－1)加入石英比色皿中，搖勻，靜置5 min，然后逐次加入10 uL的4-AAP溶液，搖勻，靜置5 min，測定混合體系的熒光光譜，考查金屬離子對4-AAP與BSA結合作用的影響．

2　結果與討論

2．1 4-AAP對BSA熒光光譜的影響

蛋白質結構中因含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基而具有內源熒光．通過熒光光譜的變化可以反映小分子、金屬離子等物質與蛋白質相互作用的情況［5］．圖1為在292 K時，4-AAP對BSA熒光光譜的影響．BSA的最大發射峰位于348．5 nm附近處．隨著4-AAP濃度的增大BSA的熒光發射峰強度明顯減弱，發生熒光猝滅;最大發射峰位藍移到346．5 nm處，藍移2 nm．表明4-AAP與BSA發生了相互作用，4-AAP的加入有可能改變了氨基酸殘基周圍的微環境［5］．

圖1　4-AAP對BSA熒光光譜的影響Fig．1 Effect of 4-AAP on fluorescence spectra of BSA

蛋白質的熒光猝滅機制主要包括動態猝滅和靜態猝滅，根據Stern-Volmer方程［6］F0/F = 1 + KSV［c］= 1 + Kqτ0［c］作出4-AAP對BSA熒光猝滅的Stern-Volmer曲線，如圖2所示，求出292 K時猝滅常數KSV=4．75×104L·mol－1和猝滅速率常數Kq=4．75×1012L·mol－1·s－1．

Kq值遠大于各類猝滅劑對生物大分子的最大擴散碰撞猝滅常數2．0×1010L·mol－1·s－1［6］，由此推斷4-AAP對BSA的熒光猝滅作用主要是靜態猝滅．

圖2　4-AAP對BSA的Stern-Volmer曲線Fig．2 Stern-Volmer curves for 4-AAP-BSA

2．2 4-AAP與BSA的結合作用

在靜態猝滅中，小分子與蛋白質的結合作用可以用公式lg( F0/F－1) = lgKA+ nlg［c］加以描述［7］，式中KA為4-AAP與白蛋白分子的結合常數，n為結合位點數．在292 K時，以lg( F0/F－1)對lg［c］作圖(圖3)．由直線的斜率及截距分別求得反應的結合常數KA及結合位點數n，見表1． 2．3不同金屬離子對4-AAP與BSA相互作用的影響

圖3　lg［c］與lg( F0/F－1)的關系Fig．3　Plot of lg［c］versus lg( F0/F－1)

固定BSA與金屬離子( Ca2+、Zn2+、Mg2+)的濃度，分別加入不同濃度的4-AAP，在292 K時考查金屬離子對4-AAP與BSA相互作用的影響，結果見表1．表1顯示，在Ca2+、Zn2+和Mg2+存在下，4-AAP對BSA的熒光猝滅作用略有減小，但靜態猝滅仍是導致4-AAP對BSA熒光猝滅的主要成因; 4-AAP與BSA的結合位點數及結合常數增大，說明金屬離子首先和BSA發生一定程度的絡合，加入4-AAP分子后，4-AAP分子通過金屬離子增強了與BSA的結合作用，金屬離子起到了“離子架橋”的作用［8］．

表1　292 K時金屬離子存在下4-AAP與BSA作用的參數Table 1 Quenching reactive parameters of 4-AAP and BSA in the presence of metal ions at 292 K

3　結論

采用熒光光譜法探討了3種金屬離子對4-氨基安替比林和BSA相互作用的影響．金屬離子存在下，4-AAP對BSA的熒光猝滅機制仍為靜態猝滅;4-AAP與BSA的結合常數和結合位點數均增大，金屬離子的參與促進了4-AAP與BSA的結合作用．該研究對于小分子在體內的運輸過程及作用機理具有一定的意義．

參考文獻:

［1］YU X Y，LIAO Z X，JIANG B F，et al．The interaction between 4-aminoantipyrine and bovine serum albumin: Multiplespectroscopic and molecular docking investigations ［J］．Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy，2014，133: 372－377．

［2］CAO S H，JIANG X Y，CHEN J W．Effect of zinc ( II) on the interactions of bovine serum albumin withfiavonols bearing different number of hydroxyl substituent on B-ring ［J］．J Inorganic Biochem，2010，104( 2) : 146－152．

［3］張懷斌，榮先國．三價鐵對燈盞花素與牛血清白蛋白相互作用的影響［J］．化學研究，2013，24( 3) : 224－227．

［4］張懷斌，馬麗英，劉向勇，等．Eu(Ⅲ)、Cu(Ⅱ)對燈盞花素與BSA作用的擾動［J］．化學試劑，2012，34 ( 12) : 1068－1072．

［5］ZHANG P J，LAN P，MA Y N，et al．Spectroscopic investigation on the interaction of Cr( VI) with bovine serum albumin ［J］．J biochem mole toxicol，2012，26( 2) : 54 －59．

［6 ］CHI Z X，LIU R T．Phenotypic characterization of the binding of tetracycline to human serum albumin ［J］．Biomacromolecules，2011，12( 1) : 203－209．

［7］付彩霞，王曉艷，高宗華．鹽酸苯肼與BSA的相互作用［J］．化學研究與應用，2013，25( 5) : 642－646．

［8］劉雪峰，李磊，方云，等．中藥成分七葉內酯-BSA-金屬離子的相互作用［J ］．化學研究與應用，2007，19 ( 2) : 145－149．

［責任編輯:任鐵鋼］

The effect of metal ions on the interaction between 4-aminoantipyrine and bovine serum albumin

GAO Zonghua*，FU Caixia，WANG Xue，ZHANG Huaibin

( Pharmaceutical College，Binzhou Medical University，Yantai 264003，Shandong，China)

Abstract:The interaction between bovine serum albumin ( BSA) and 4-Aminoantipyrine( 4-AAP) was investigated using fluorescence spectroscopy in the presence of metal ions ( Ca2+，Zn2+and Mg2+)．The results suggested that the quenching constant decreased in the presence of metal ions，but the quenching mechanism was not changed．The binding constants ( KA) and numbers of binding site ( n) increased．The anslysis indicated that the effect of metal ions on the interaction between 4-AAP and BSA was related to the metal ions function as the bridge ions．

Keywords:4-aminoantipyrine; bovine serum albumin; interaction; metal ions

作者簡介:高宗華( 1966－)，女，教授，研究方向為有機合成和光譜分析．*通訊聯系人，E-mail: gzh3308@ 163．com．

基金項目:山東省教育廳科技計劃項目( J08LG15)．

收稿日期:2015－08－15．

中圖分類號:O657．3

文獻標志碼:A

文章編號:1008－1011( 2016) 01－0051－03