高效液相色譜串聯質譜法測定牛奶中的頭孢尼西

周　昱，張　元，周一平，袁明美，馮雪松

(中國醫科大學藥學院，遼寧沈陽110013)

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高效液相色譜串聯質譜法測定牛奶中的頭孢尼西

周昱，張元，周一平，袁明美，馮雪松*

(中國醫科大學藥學院，遼寧沈陽110013)

摘要:建立了牛奶中頭孢尼西的高效液相色譜串聯質譜( HPLC-MS/MS)快速測定方法．樣品采用乙腈提取，離心( 10 000 rmp，10 min)，上清液加入乙腈飽和的正己烷，振蕩，取乙腈層，進行分析．采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱為分析柱，以5 mmol/L乙酸銨和乙腈為流動相，梯度洗脫分離，流速0．8 mL/min，溫度35℃，進樣量5 μL，采用電噴霧負離子模式進行電離，選擇反應監測模式進行檢測，外標法定量分析．頭孢尼西在1．0～100 μg/L濃度范圍內線性良好( r2=0．997)，檢出限( LOD)為0．04 μg/L，定量限( LOQ)為0．15 μg/L，采用低、中、高3個添加水平，平行測定6次，所得平均回收率分別為90．3%、87．4%、93．5%，相對標準偏差( RSD)分別為4．5%、2．3%、2．1%．

關鍵詞:牛奶;頭孢尼西;高效液相色譜;質譜

β-內酰胺類抗生素是歷史最悠久的抗微生物藥物，同時也是使用量最大和最重要的一類抗生素［1］，主要用于抑制革蘭氏菌［2］，如葡萄球菌、肺炎球菌、鏈球菌、大腸桿菌、嗜血桿菌、沙門氏菌等．β-內酰胺類抗生素作為奶牛飼養過程中經常使用的一類抗生素，其在牛奶中的殘留將會對人體健康帶來重要影響［3－5］．如引起過敏反應、造成泌尿系統損害和引起血液系統的反應，甚至偶爾引發肝炎［6］等．為了避免消費者受到食品中抗生素殘留的危害，保護人民的身體健康，各國都對各種抗生素制定了嚴格的最高殘留限量( MRL)［7］．如歐盟規定動物組織和牛奶中各類頭孢菌素的MRL在20～100 μg/kg之間，其中牛奶中頭孢喹諾的MRL為20 μg/kg，而頭孢噻呋的MRL為100 μg/kg．頭孢尼西作為第二代注射用廣譜長效頭孢菌素，其抗菌譜與頭孢孟多類似，主要用于敏感菌所致的下呼吸道感染、尿路感染以及敗血癥等，殘留在牛奶中的頭孢尼西可造成消費者抽搐、頭痛、精神緊張等健康問題．

目前，β-內酰胺類抗生素的檢測方法主要有微生物法、免疫測定法、氣相色譜法、液相色譜法以及液相色譜-質譜法等［8－15］．液相色譜-質譜法作為一種高靈敏度和高選擇性的檢測方法，其檢出限越來越低，提供的碎片信息越來越多，在食品獸藥殘留中的應用也日趨廣泛［16－17］．然而由于文獻中所見報道的前處理繁瑣，耗時較長，并且頭孢尼西在常溫條件下極不穩定．預實驗證明頭孢尼西鈉1 000μg/L的標準品溶液在室溫下放置一天將分解10%，因此關于頭孢尼西的液相色譜-質譜檢測方法尚未見報道．本研究采用乙腈提取牛奶中的頭孢尼西，而后采用高效液相色譜串聯質譜法建立了牛奶中頭孢尼西含量的測定方法，該方法具有前處理簡單、檢出限低、靈敏度高、準確性好的優點，可用于日常食品樣品中頭孢尼西含量的測定．

1　實驗部分

1．1儀器與試劑

液相色譜儀1260 (美國Agilent公司)串聯API5500三重四極桿質譜儀(美國Applied Biosystem公司) ; Avanti J-30I離心機(美國Beckman Coulter公司) ; Milli-Q超純水處理系統(美國Millipore公司) ; SA-31振蕩器(日本Yamato公司) ;旋轉蒸發儀(瑞士BUCHI公司)．

頭孢尼西鈉(純度≥99%)，購自德國Dr．Ehrenstorfer公司;乙腈、正己烷、乙酸銨為色譜純，購自美國J＆K公司;實驗用水由Millipore純水儀制備．

1．2溶液配制

乙腈飽和正己烷:取100 mL正己烷和50 mL乙腈加入250 mL分液漏斗中，振搖1 min，靜置分層后棄掉乙腈．

5 mmol/L乙酸銨:取385．4 mg乙酸銨加入1 L溶劑瓶內，去離子水定容．

1．3實驗步驟

稱取5 g試樣(精確至0．01 g)置于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，均質器均質2 min，提取液使用高速冷凍離心機在10℃，10 000 r/min離心10 min，然后加入10 mL乙腈飽和正己烷，震蕩1 min，棄掉正己烷，過膜，上機．

1．4實驗條件

液相色譜條件:色譜柱ZORBAX Eclipse XDBC18 column ( 150 mm×4．6 mm，5 μm) ;柱溫35℃;樣品室溫度4℃;進樣體積5 μL;流動相A為5 mmol/L乙酸銨溶液，流動相B為乙腈．梯度洗脫程序: 0～3．0 min，5%～50% B; 3．1～4．0 min，95% B; 4．1 ～5．0 min，5% B，流速為0．8 mL/min．

質譜條件:電噴霧電離源5 500℃，負離子模式，多反應監測( MRM) ;實驗中所用的氣體均為高純氮氣，碰撞氣( CAD)壓力為7 kPa，氣簾氣( CUR)壓力為30 kPa，霧化氣( GS1)壓力為55 kPa，輔助氣( GS2)壓力為65 kPa．電噴霧電壓( IS)為－4．5 kV，去溶劑溫度( TEM)為600℃，碰撞室出口電壓( CXP)為－21 V．分析物的定性/定量離子對，去簇電壓( DP)及碰撞電壓( CE)見表1．

表1　頭孢尼西的質譜參數Table 1 Mass spectrometer parameters of Cefonicid

2　結果與討論

2．1樣品前處理條件的優化

多數乳制品樣品中含有大量的蛋白質和脂肪，這會給后續的檢測帶來極大的干擾，所以在樣品前處理中需要使用酸或有機溶劑將其中大部分的蛋白成分進行變性和沉淀．考慮到頭孢尼西含有的四元環結構在強酸條件下不穩定，因此樣品提取及沉淀蛋白應避免強酸的使用．本研究對比了有機溶劑甲醇和乙腈的提取效果，發現乙腈的提取效率優于甲醇的，結果見圖1．乙腈提取物經過離心取上清液，用乙腈飽和的正己烷對上清液進行液液萃取，以有效去除牛奶中的脂肪．此方法離心后可以直接上機檢測，不需采用SPE柱凈化處理，大大縮短了前處理時間，并且節省了SPE柱耗材費用．

圖1　不同試劑的提取效率對比Fig．1 Comparison of extract efficiency of different solvent

2．2色譜條件優化

液相色譜-質譜聯用技術用于頭孢尼西的檢測尚未見報道，因此本研究考察了甲醇-水和乙腈-水作為流動相時檢測頭孢尼西的靈敏度(圖2)．采用乙腈-水作為流動相，100 ppb頭孢尼西的響應強度是甲醇-水作為流動相時的2倍，并且甲醇-水作為流動相的噪音較高，本研究選擇乙腈-水為流動相．

圖2　不同流動相頭孢尼西標準溶液響應圖Fig．2 Comparison of different mobile phase for cefonicid

2．3質譜條件的優化

在ESI+和ESI－離子化模式下，考察了頭孢尼西的電離效果．實驗表明，頭孢尼西在ESI－電離方式下響應較好，這可能與頭孢尼西呈弱酸性相關．頭孢尼西的分子結構見圖3．頭孢尼西的定量離子對提取離子色譜圖見圖4．

圖3　頭孢尼西分子結構圖Fig．3 Molecular structure of Cefonicid

圖4　定量離子對提取離子色譜圖Fig．4 Extracted ion chromatograph of Cefonicid

使用陰性牛奶提取液逐級稀釋標準溶液至濃度為1、5、10、25、100 μg/L，在優化的色譜和質譜條件下測定，根據待測物濃度和定量離子峰面積關系進行線性回歸．對陰性空白樣品提取液進行加標實驗，根據各定量離子3和10倍信噪比( S/N)對應樣品中目標化合物的濃度，得到檢出限和定量限(表2)．

表2　頭孢尼西線性關系、檢出限( LOD)和定量限( LOQ)Table 2 Quadratic relationships，limits of detection ( LOD) and limits of quantification ( LOQ) of Cefonicid

2．4回收率和精密度

在空白牛奶樣品中添加3個濃度水平( 0．15、0．3、0．6 μg/L)的標準溶液，每個添加水平平行測定6次，測定結果見表3．實驗結果表明，本方法的回收率在87．4%～93．5%范圍內，精密度( RSD)小于5%，這表明本方法可以應用于實際樣品的測定．

表3　頭孢尼西平均回收率和精密度Table 3 Recoveries and precisions of Cefonicid

2．5實際樣品的測定

應用本方法對30份采集自超市的牛奶樣品進行測定，均未檢出頭孢尼西．下一步將擴大樣品范圍、對集貿市場等地的樣品也進行檢測和分析，以摸清我國目前的牛奶中頭孢尼西使用情況．

3　結論

通過對牛奶樣品前處理方法的優化，建立了牛奶中頭孢尼西的LC-MS/MS檢測方法．該方法具有快速簡便、準確度高、檢出限低的特點，能夠滿足牛奶中頭孢尼西的檢測需求，其儀器條件也適用于其他類基質中頭孢尼西的檢測．

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［責任編輯:任鐵鋼］

Determination of cefonicid in milk by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

ZHOU Yu，ZHANG Yuan，ZHOU Yiping，YUAN Mingmei，FENG Xuesong*

( School of Pharmacy，China Medical University，Shenyang 110013，Liaoning，China)

Abstract:A method based on high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry ( HPLC-MS) was established for the determination of cefonicid in milk．The milk sample was extracted with acetonitrile．Then，samples were centrifuged ( 10 000 r/min，10 min) to obtain the supernatant．After that the supernatant was added into acetonitrile-saturated hexane solutions and shaken to obtain the acetonitrile-soluble substances which were directly determined by HPLC-MS．The separation was performed on an ZORBAX Eclipse XDB-C18 column ( 150 mm×4．6 mm，5 μm) with 5 mmol/L ammonium acetate and acetonitrile gradient solution as the mobile phase at a flow rate of 0．8 mL/min and 35℃．The sample injection volume was 5 μL．The electrospray source was operated in the negative ion mode，and monitored in the selective reaction monitoring ( SRM) mode．The concentration of cefonicid in the range of 1．0－100 μg/kg was linearly correlated to the peak area，with correlation coefficients 0．997．The limit of detection ( LOD) and limit of quantitation ( LOQ) were determined to be 0．04 μg/ L and 0．15 μg/L，respectively the recoveries of cefonicid were from 87．4% to 93．5% with the relative standard deviations ( RSD) of 2．1% to 4．5%( n = 6)．

Keywords:milk; cefonicid; high performance liquid chromatography; mass spectrometry

作者簡介:周昱( 1989－)，女，碩士生，從事藥劑學及藥物分析研究．*通訊聯系人，E-mail: voncedar@ 126．com．

基金項目:遼寧省科學技術廳自然科學基金( 201202252)．

收稿日期:2015－11－09．

中圖分類號:R917

文獻標志碼:A

文章編號:1008－1011( 2016) 01－0077－04