鈦酸鹽納米管-聚苯胺-金納米顆粒復合材料的制備及其生物電化學性能

朱　杰，霍小鶴，劉小強*，劉繡華，2

( 1．河南大學化學化工學院，河南開封475004; 2．河南大學河南省天然藥物與免疫工程重點實驗室，河南開封475004)

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鈦酸鹽納米管-聚苯胺-金納米顆粒復合材料的制備及其生物電化學性能

朱杰1，霍小鶴1，劉小強1*，劉繡華1，2

( 1．河南大學化學化工學院，河南開封475004; 2．河南大學河南省天然藥物與免疫工程重點實驗室，河南開封475004)

摘要:采用水熱法制備出鈦酸鹽納米管( TNTs)，然后使用氧化聚合法將苯胺聚合到TNTs表面生成聚苯胺( PANI)，最終將金納米粒子還原到PANI表面制備出三元復合納米材料( TNTs-PANI-GNPs)．其中PANI作為交聯劑鏈接起TNTs和GNPs形成穩定和結合緊密的三元復合納米材料，不同的光譜和顯微圖像技術證實了三元復合納米材料的成功合成．我們將辣根過氧化物酶( HRP)與三元復合納米材料充分混合均勻后涂抹于玻碳電極表面，伏安實驗結果證明HRP已實現在TNTs-PANI和TNTs-PANI-GNPs修飾電極上的直接電子轉移，而且后者相較于前者對過氧化氫的催化還原電流增強了大約74．9%．TNTs-PANI-GNPs復合納米材料修飾的生物傳感器的優越電化學性能主要歸因于復合材料中TNTs、PANI和GNPs三者之間的協同作用，將優點最大化，將缺點最小化．

關鍵詞:水熱法;氧化聚合法;三元復合納米材料;辣根過氧化物酶;電化學性能

氧化還原酶修飾電極在生物傳感器、生物電子學和生物燃料電池方面具有良好的應用前景，因而近年來受到了廣泛的關注和研究［1］，在這些應用中酶與電極之間的電子轉移行為是決定所制備酶器件性能的關鍵因素［2］．由于電極材料和酶固定方法是影響酶與電極之間直接電子傳遞的重要因素［3］，因此電極修飾材料的選擇和制備也就決定了氧化還原酶修飾電極的性能．鈦酸鹽納米管( TNT)由于其優異的生物相容性、高比表面積、強吸附性、化學惰性和多孔等優異性能而被廣泛應用于構筑電化學生物傳感器［4］．但受限于其半導體特性，鈦酸鹽納米管的導電性較差，不利于其在化學修飾電極和傳感器的應用．因此，如何在保持鈦酸鹽納米管各項優異性能的基礎之上大幅提高其導電性是我們急需解決的科學問題之一．近幾年來，貴金屬，特別是金納米顆粒( GNP)，因其具有高導電性、生物親和性和高比表面積等優點而被廣泛應用于電化學生物傳感器的制備中，尤其是金納米顆粒能夠促進氧化還原酶與電極之間的直接電子傳遞，這非常有助于改善酶生物傳感器的分析性能．但金納米顆粒極易團聚，必須與其他納米材料結合生成復合納米才能得以應用．例如，WANG等［8］利用化學還原法將金納米顆粒種子修飾在二氧化鈦納米顆粒表面，并以此為電極修飾材料成功研制出辣根過氧化酶生物傳感器，該傳感器電催化還原H2O2的線性范圍為4．1×10－5～6．3×10－4mol·L－1，檢測限為5．9× 10－6mol·L－1．

有機高分子聚合材料-聚苯胺( PANI)由于擁有高電導性、導電性可調、強光催化性能和優良的環境與熱穩定性而被應用于光伏器件［5］、氣體傳感器［6］和鋰電池［7］等．但是聚苯胺也具有低機械強度、可塑性和生物相容性較差等缺點，導致其在電極表面的應用受到限制，因此聚苯胺需要與其他材料結合生成復合納米材料來改進其性能，從而拓展其應用．據報道，聚苯胺分子非常有助于金納米顆粒在聚苯胺納米纖維上的沉積［16］．其具體原理是:首先，高氯酸金陰離子( AuC)通過其表面負電荷與帶有正電荷的質子化仲胺的靜電相互作用吸附在鹽酸摻雜的聚苯胺骨架上;然后，聚苯胺表面的AuC原位還原為金納米粒子．

為了制備具有優良光電性能的復合納米材料，并將其應用于電化學和光電化學傳感器的制備，本文作者采用水熱法合成鈦酸鹽納米管為前體，利用氧化聚合法將苯胺聚合在鈦酸鹽納米管表面，再利用化學還原法將金納米顆粒沉積在聚苯胺表面從而制備出TNT-PANI-GNP復合納米材料．同時，為了提高生物傳感器的穩定性和增強辣根過氧化酶( HRP)與TNT-PTA-GNP之間的電子轉移，本實驗采用將HRP巰基化的方法使HRP通過－SH鍵與TNT-PTA-GNP結合的更緊密、牢固．最后，利用離子型聚合物Nafion和親水性離子液體( Hydrophilic I-onic Liquids，HIL) : 1-癸基-3-甲基咪唑溴鹽將巰基化的HRP和TNTs-PTA-GNP材料固定于玻碳電極表面，成功制備出TNT-PTA-GNP | HIL| Nafion | HRP電極，并應用于H2O2的催化降解．在復合材料中，聚苯胺不僅可以提高鈦酸鹽納米管的導電性，而且可以促進金納米顆粒在鈦酸鹽納米管上的沉積，從而增強金納米顆粒和鈦酸鹽納米管之間的聯系．因此，在鈦酸鹽納米管-聚苯胺-金納米顆粒復合物的合成中，聚苯胺作為交聯劑，增強了三元復合物的穩定性和電化學性能．

1　實驗部分

1．1試劑與儀器

二氧化鈦納米顆粒( P25，天津市化學試劑三廠) ; HAuCl4·3H2O，辣根過氧化酶( HRP)，3-( 2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯( SPDP)，二硫蘇糖醇( DTT)，二甲亞砜( DMSO)均購買于美國Sigma-aldrich公司;檸檬酸三鈉(北京化工) ;硼氫化鈉(國藥集團化學試劑有限公司) ; 1-癸基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽( ［Demim］Br，中國上海成捷化學有限公司) ;以上試劑均為分析純，實驗用水均為去離子水．

Zeba脫鹽離心柱(美國賽默飛世爾) ; AVATAR360型傅立葉紅外光譜儀( FT-IR，美國尼高力公司) ; UV-4100型紫外可見分光光度計(日本日立公司) ; Tecnai G220型透射電子顯微鏡( TEM，美國菲達康公司) ; X-PertPro型X射線衍射儀( XRD，荷蘭飛利浦公司) ; CHI630D型電化學分析儀(上海辰華儀器有限公司) ; IM6ex型電化學工作站(德國ZAHNER公司)．

1．2 TNT-PANI-GNP復合納米材料的制備

首先，稱取0．450 0 g多晶型TiO2納米顆粒，置于含有120 mL 10 mol·L－1的NaOH溶液的高壓反應釜里，充分攪拌均勻，密封，將高壓反應釜放進烘箱內，保持120℃反應48 h;自然冷卻至室溫，將反應釜內的溶液移至燒杯中，依次用0．1 mol·L－1的HCl、去離子水清洗至中性，離心分離，再用去離子水洗至無Cl－;離心，在真空干燥箱內60℃干燥，所得固體即為鈦酸鹽納米管( TNTs)．

然后，稱取上述制備的0．280 0 g TNTs加入10 mL 0．1 mol·L－1的HCl溶液中超聲30 min，加入4．5 mL的0．1 mol·L－1的苯胺HCl溶液，在0～5℃溫度下逐滴滴加共4．5 mL的0．1 mol·L－1的過硫酸銨HCl溶液于上述混合溶液中，反應3 h，靜置一夜，離心，洗滌．在真空干燥箱內60℃干燥，所得固體即為鈦酸鹽納米管-聚苯胺( TNTs-PANI)．

接著，稱取上述制備的15 mg TNT-PANI復合物并置于15 mL的去離子水中，超聲30 min;再依次稱取0．004 0 g HAuCl4·3H2O和0．002 0 g檸檬酸鈉加入到2 mL的去離子水中，將此混合液加入到上述的TNT-PANI懸濁液中;然后，邊攪拌邊快速地加入1 mL 2 g·L－1的NaBH4溶液，將此混合液在室溫下溫和攪拌超過20 min;離心，洗滌，在60℃下真空干燥，得到金納米顆粒修飾的鈦酸鹽納米管-聚苯胺，即三元復合納米材料TNT-PANI-GNP．

1．3 HRP巰基化

首先，稱取1 mg SPDP溶于160 μL的DMSO中，得到20 mmol·L－1的SPDP溶液;依次量取12．5 μL 20 mmol·L－1SPDP，稱取1 mg HRP溶加入500 μL的PBS-EDTA溶液中( pH = 7．5，PBS濃度為20 mmol·L－1，EDTA濃度為1 mmol·L－1)，在室溫下反應30～60 min;兩個脫鹽柱在2 500 r/min的轉速下離心5 min，以除去柱子中儲存液，再用醋酸鈉緩沖溶液清洗2～3次以平衡兩柱子，然后將上述SPDP與HRP反應液過柱子，以除去反應副產物和過量的SPDP;接下來，稱取0．005 4 g DTT溶于200 μL的醋酸鈉緩沖溶液中，得到175 mmol·L－1的DTT溶液;將得到的DTT溶液與500 μL的SPDP處理過的HRP溶液混合，反應30 min，反應得到巰基化的HRP;最后，利用PBS-EDTA溶液進行溶液交換2～3次，將巰基化HRP溶液過柱子，以除去反應副產物及過量的DTT，脫鹽，收集，得到純化的巰基化HRP．

1．4修飾電極的制備

首先，將玻碳電極依次用0．3和1．0 μm的Al2O3粉末在拋光布上拋光，然后分別用無水乙醇和去離子水超聲清洗，清洗過的電極在室溫下晾干，備用;接下來，分別取300 μL 1．5 g·L－1的HRP溶液和50 μL Nafion加入到30 mg HIL與復合納米材料TNTs-PTA-GNP的混合物中(質量比為1∶2)，在恒溫振蕩器(空氣浴)中保持2℃振蕩4 h;最后，取4 μL混合液滴于玻碳電極表面，在冰箱中4℃晾干備用，從而得到巰基化HRP修飾電極．本實驗中的所有修飾電極都運用類似方法制備而成．

1．5電化學性能測試

本實驗的電化學測試均使用三電極體系(修飾電極為工作電極，鉑柱電極為對電極，Ag/AgCl ( 3．0 molL－1KCl)電極為參比電極)在CHI630D型的電化學工作站上進行．電化學測試前，反應池首先通氮氣15 min;測試中，在反應池上方保持N2飽和的條件．循環伏安實驗中的掃描速率為50 mV·s－1，底液為0．05 mol·L－1pH=7．0的PBS．

2　結果與討論

2．1樣品的TEM表征

圖1( a)，( b)和( c)分別是樣品TNTs，TNT-PANI 和TNT-PANI-GNP的TEM圖．由圖1( a)可以看到，我們已使用水熱法成功合成出鈦酸鹽納米管，并且管徑均勻，平均直徑約為8～10 nm，長度大概為幾百納米;經過苯胺氧化聚合反應，在圖1( b)中可以清楚地看到鈦酸鹽納米管被半透明的無定型聚苯胺包覆，在圖1( a)中原本分散的納米管也粘附在一起，這證明了聚苯胺的成功生成;最終，我們利用化學還原法將金納米顆粒沉積到TNT-PANI二元復合物表面，從圖1( c)可以清晰的看到，金納米顆粒較為均勻的分散在鈦酸鹽納米管-聚苯胺表面，團聚較少，金納米顆粒的直徑約為6～8 nm，大小較為均勻，同以往將金納米顆粒直接沉積在鈦酸鹽納米管上的方法相比，聚苯胺作為交聯劑的方法更有利于金納米的沉積，金納米顆粒的沉積密度更大一些．

圖1　樣品的TEM圖Fig．1 TEM images of the as-prepared samples

2．2樣品的FT-IR分析

圖2a、b、c、d分別是TNTs，PANI，TNT-PANI和TNT-PANI-GNP composite的FT-IR光譜圖．從圖2中可以看到，4條紅外譜線在3 000～3 700 cm－1之間的吸收帶均為吸附在各種材料表面的－OH基團的伸縮振動峰;另外，在譜線a中，介于400～700 cm－1范圍內的峰歸屬于TNTs的Ti-O-Ti吸收峰［9］，這是鈦酸鹽納米材料的特征紅外吸收峰，一般情況下二氧化鈦或鈦酸鹽材料的紅外譜圖均有此峰存在．而在譜線b中，中心峰位置約為1 242 cm－1的吸收帶歸屬于聚苯胺中的C－N+?伸縮振動;而峰位置約為1 299，1 126和797 cm－1的吸收帶分別對應于二芳氨基的C－N伸縮，N=Q=N( Q代表醌環)伸縮振動以及C－H的面外彎曲振動;此外，1 561 cm－1和1 474 cm－1峰分別歸屬于醌環和苯環的伸縮振動．以上所有的特征峰均歸屬于高導電性的苯胺綠型聚苯胺［10］，它們的出現證實了譜線b為苯胺綠型聚苯胺的紅外吸收譜圖．更為重要的是，我們可以看到譜線c包含了譜圖a和b所有的特征峰，這表明我們已成功合成出TNT-PANI二元復合物;值得注意的是，生成二元復合物之后，譜圖b中純聚苯胺在1 561、1 474、1 299和1 242 cm－1的峰分別紅移到了1 574、1 490、1 305和1 249 cm－1處，這很可能是由于聚苯胺氨基氮原子與鈦酸鹽氧或鈦原子之間強相互作用所引起的;通過化學還原法將金納米顆粒沉積到TNT-PANI二元復合物上面之后，我們觀察到譜線d相對于c，－OH的伸縮振動峰偏移了29 cm－1，這可以歸因于金納米顆粒與鈦酸鹽表面－OH強相互作用所引起［11］．

圖2　樣品的FT-IR圖譜Fig．2 FT-IR spectra of the as-prepared samples

2．3樣品的XRD分析

圖3a、b和c分別為納米材料TNTs，TNT-PANI 和TNT-PANI-GNP的XRD圖．從譜線a中可以看出，鈦酸鹽納米管在大約9．6°、24．7°、28．3°、48．9°和61．8°出現特征衍射峰，分別對應于其( 200)、( 110)、( 600)、( 020)和( 002)晶面，可據此判斷鈦酸鹽納米管為正交晶型［12］．譜線b為TNT-PANI二元復合物的XRD圖，圖中除了鈦酸鹽納米管的幾個特征峰外，還可觀察到15．1°，20．5°衍射峰分別對應于聚苯胺的( 010)和( 100)晶面．最重要的是，譜線c中除了出現前述鈦酸鹽納米管和聚苯胺的特征峰外，還在38．6°，44．8°，64．9°和77．8°存在明顯衍射峰，據文獻報道分別對應于金納米顆粒的( 110)、( 200)、( 220)和( 311)晶面［13］．因此，從XRD圖可以得出結論，金納米顆粒已成功的沉積在TNTPANI復合物表面，三元復合物TNT-PANI-GNP已合成出來．

圖3　樣品的XRD圖Fig．3 XRD spectra of the as-prepared samples

2．4復合納米材料的生物電化學性能研究

我們合成納米復合材料的最終目的是以TNTPANI和TNT-PANI-GNP作為氧化還原酶的載體構建電化學或光電化學生物傳感器．因此本實驗將一種常見氧化還原酶HRP與復合材料充分均勻混合后修飾于玻碳電極表面制備出酶修飾電極，然后利用循環伏安法對制備的修飾電極進行電化學性能研究，從而判斷所合成材料是否適合于制備生物傳感器．如圖4所示，曲線a為TNT-PANI-GNP|HIL|Nafion|GCE電極在0．05 molL－1PBS緩沖溶液中( pH= 7．0)的循環伏安圖．可以看到，該修飾電極在電位－0．45～0．15 V范圍內沒有出現任何氧化還原峰，說明該材料沒有電化學活性，故不會產生電化學干擾; 而TNT-PANI | HIL | Nafion | HRP | GCE(曲線b)與TNT-PANI-GNP|HIL| Nafion| HRP | GCE(曲線c)在相同實驗條件下均出現了明顯的電化學還原峰，這表明了電極表面修飾體系中的HRP自身發生了電子轉移;此外，曲線c的還原電流明顯強于曲線b的，這表明了三元復合材料中的GNP起到了一定的催化作用，提高了復合材料的導電能力，增強了HRP與電極之間的直接電子傳遞，再加上復合材料給HRP提供了良好的生物微環境，使其能夠顯現出較好的電生物活性．因此，可以得出結論: TNT-PANI 和TNT-PANI-GNP復合物均適合構建生物修飾電極，而氧化還原酶在后者當中有更好的直接電子傳遞行為．

圖4　納米材料修飾電極的循環伏安描述Fig．4 Cyclic voltammetric characterization of different nano-material modified electrodes

3　結論

首先采用水熱法合成出TNTs，然后利用氧化聚合法將苯胺聚合在TNTs表面生成TNT-PANI二元復合物，最終使用化學還原法將金納米顆粒沉積在TNT-PANI表面合成出三元復合物TNT-PANI-GNP，并通過TEM、XRD、FT-IR等分析手段對其進行了表征．結果證明3種成份TNTs、PANI和GNPS緊密結合在一起，成功生成三元復合物．我們又以TNT-PANI 和TNT-PANI-GNP為電極修飾材料分別制備了HRP酶電化學傳感器，并利用循環伏安法對其進行生物電化學性能研究．結果表明，TNT-PANI-GNP復合納米材料結合了PANI和GNPs的良好導電性，以及TNTs 和GNPs良好的生物相容性，改善了它們各自的缺點，提高了材料的性能，促進了氧化還原酶HRP與電極之間的直接電子交換．因此，該材料在電化學生物傳感器及生物電極材料制備中具有較好的應用價值．

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［責任編輯:吳文鵬］

Preparation of titanate nanotubes-polyaniline-gold nanoparticle composite and its bioelectrochemistry study

ZHU Jie1，HUO Xiaohe1，LIU Xiaoqiang1*，LIU Xiuhua1，2

( 1．College of Chemistry and Chemical Engineering，Henan University，Kaifeng 475004，Henan，China;
2．Key Laboratory of Natural Medicine and Immunology of Henan Province，Henan University，Kaifeng 475004，Henan，China)

Abstract:A ternary composite consisting of titanate nanotubes ( TNTs)，polyaniline ( PANI) and gold nanoparticles ( GNPs) was prepared for the first time and applied for the fabrication of a biosensor using horseradish peroxidase ( HRP) as model enzyme．TNTs were initially synthesized from TiO2nanoparticles using a hydrothermal method．Aniline was then polymerized on TNTs through an oxidation polymerization method．The GNPs were eventually deposited on PANI to form a ternary composite，in which PANI served as a cross linker between TNTs and GNPs to strengthen their contact．Different spectroscopic and microscopic techniques have confirmed the successful formation of the ternary composite．The ternary composite was then used for the immobilization of horseradish peroxidase ( HRP) on electrode surface．The voltammetric results demonstrated that the direct electron transfer of HRP had been achieved at both TNTs-PANI and TNTs-PANI-GNPs modified electrodes and the catalytic reduction current at the later towards H2O2has enhanced～74．9% compared to that at the former．The excellent electrochemical performance of the modified electrode can be ascribed to the superior synergistic properties of TNTs，PANI and GNPs．

Keywords:hydrothermal method; oxidation polymerization method; ternary composite; horseradish peroxidase; electrochemical performance

作者簡介:朱杰( 1989－)，男，碩士生，主要從事新型復合納米材料光電化學生物傳感器的研究．*通訊聯系人，E-mail: 13781157777@ 163．com．

基金項目:中國博士后科學基金會資助項目( 2012M511569)

收稿日期:2015－08－31．

中圖分類號:O632．3

文獻標志碼:A

文章編號:1008－1011( 2016) 01－0107－05