盾葉薯蕷中薯蕷總皂苷生物酶預處理法提取工藝研究

楊光義，雷 攀，2，杜士明，2，惠小娜，葉 方，張晨寧，魏晉寶

（1．湖北省十堰市太和醫院·湖北醫藥學院附屬醫院，湖北 十堰 442000； 2．湖北中醫藥大學，湖北 武漢 430065）

盾葉薯蕷中薯蕷總皂苷生物酶預處理法提取工藝研究

楊光義1，雷 攀1，2，杜士明1，2，惠小娜1，葉 方1，張晨寧1，魏晉寶1

（1．湖北省十堰市太和醫院·湖北醫藥學院附屬醫院，湖北 十堰 442000； 2．湖北中醫藥大學，湖北 武漢 430065）

目的 建立高效提取盾葉薯蕷中薯蕷總皂苷的新方法。方法 以薯蕷總皂苷的得率為指標，采用單因素試驗對生物酶預處理過程的酶解溫度、pH、生物酶預處理水用量、酶用量、酶解時間5個因素進行考察，以正交試驗設計對醇提總皂苷過程的乙醇濃度、料液比、提取時間、提取次數4個因素進行考察。結果 生物酶預處理過程最佳酶解條件：酶解溫度70℃，pH＝5．5，生物酶預處理水用量4 L／kg，酶用量8 mL／kg，酶解時間24 h；醇提總皂苷過程最佳提取條件：60%乙醇為溶劑，料液比1∶8，提取2次，每次1．0 h。結論 新工藝可穩定高效地提取出盾葉薯蕷中的薯蕷總皂苷。

盾葉薯蕷；生物酶預處理；薯蕷總皂苷；提取工藝

盾葉薯蕷 Dioscorea Zingiberensis C．H．Wright別名黃姜、火頭根，為薯蕷科薯蕷屬多年生纏繞草質藤本植物，廣泛分布于我國的湖北、陜西、河南、湖南等地，其中湖北和陜西種植面積較大，約占全國的70%[1－2]。薯蕷皂苷（dioscin）是盾葉薯蕷根莖中的主要活性成分，具有脫敏、祛痰、抗炎、抗衰老、抗腫瘤、調血脂、免疫調節等藥理作用[3－8]。此外，薯蕷皂苷脫去糖苷鍵生成的薯蕷皂苷元是合成甾體激素類藥物和口服避孕藥的重要原料，世界上約有2／3的甾體激素類藥物都是以此為原料合成的[9]。

目前，工業生產薯蕷皂苷主要是以水或醇溶液為溶劑，直接進行回流提取。該法操作簡單，但薯蕷皂苷得率低，主要原因是淀粉和纖維素占盾葉薯蕷干重的82．5%，大部分薯蕷皂苷被緊密包裹在淀粉和纖維素中[10]，不易被提取出來。本課題組擬以生物酶除去淀粉和纖維素后，再以適宜的溶劑進行提取，從而提高薯蕷總皂苷得率。本試驗分別對生物酶預處理條件和總皂苷的提取條件進行了考察，確定了生物酶預處理法提取盾葉薯蕷中薯蕷總皂苷的最佳工藝參數。

1 儀器與材料

1．1 儀器

TU－1901型紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；AUW－120D型電子分析天平（日本島津）；RE－2000A型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；TDL－5A型離心機（德國菲恰爾公司）；VORTEX－5型漩渦混合器；pHS－25型數顯pH計（上海精密科學儀器有限公司）；SKFO－0型電熱鼓風恒溫干燥箱。

1．2 材料

盾葉薯蕷由湖北神農本草中藥飲片有限公司提供，經湖北醫藥學院生藥學教研室主任陳吉炎教授鑒定為薯蕷科植物盾葉薯蕷 Dioscorea zingiberensis C．H．Wright的根莖，粉碎，過4號篩，備用；薯蕷皂苷對照品購自中國食品藥品檢定研究院（批號為111707－201402）；纖維素酶（Celluclast）、淀粉酶（BAN 480L）均購自諾維信中國生物技術有限公司；甲醇為色譜純，乙醇、高氯酸為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2．1 薯蕷總皂苷含量測定方法[11]

2．1．1 溶液制備

精密稱取薯蕷皂苷對照品5．03 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容，得質量濃度為0．503 0 g／L對照品溶液。

取盾葉薯蕷粉末5 g，加適量水混勻，自然pH條件下，加復合生物酶（淀粉酶與纖維素酶1∶1比例混合）適量，混勻，在一定溫度條件下酶解24 h，3 000 r／min離心5 min，棄上清液，沉淀80℃烘干，研碎，得盾葉薯蕷酶解物。酶解物置100 mL圓底燒瓶中，加適量乙醇溶液，水浴回流提取1 h，離心，取上清液，沉淀再重復提取1次，合并2次上清液，置100 mL容量瓶中，加相應濃度乙醇溶液定容至刻度，搖勻，即得樣品溶液。

精密量取樣品溶液2 mL，置10 mL容量瓶中，加相應提取溶劑定容至刻度，搖勻，過濾，取續濾液，即得供試品溶液。

2．1．2 方法學考察

測定波長選擇：精密量取薯蕷皂苷對照品溶液0．2mL進行顯色。置10 mL具塞試管中，揮干溶劑后，精密加入高氯酸 5 mL，70℃水浴15 min，冰水浴中冷卻至室溫。以高氯酸為參比，在200～500 nm波長下用紫外分光光度計掃描，確定最大吸收波長，結果在406 nm波長處有最大吸收。

標準曲線繪制：精密量取薯蕷皂苷對照品溶液0．05，0．10，0．20，0．30，0．40，0．50，0．60 mL，經高氯酸顯色后于406 nm波長測定吸光度并記錄。以薯蕷皂苷含量(X)為橫坐標、吸光度(Y)為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為 Y＝3．443 3 X－0．043，R2＝0．999 2 (n＝7)。結果表明，在上述條件下，薯蕷皂苷質量濃度在0．050 3～0．301 8 g／L范圍內與吸光度呈良好線性關系。

精密度試驗：精密量取0．503 0 g／L薯蕷皂苷對照品溶液6份，每份0．1 mL，分別按顯色方法進行顯色，于406 nm波長處測定吸光度。結果吸光度的 RSD為1．16%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：分別于供試品溶液制備0，1，2，4，8 h時按顯色方法進行顯色，406 nm波長處測定吸光度。結果的 RSD為1．09%（n＝6），表明供試品溶液在8 h內穩定性良好。

重復性試驗：取樣品溶液6份，依法制備供試品溶液，并按顯色方法進行顯色，于406 nm波長處測定吸光度。結果的 RSD為2．03%（n＝6），表明該方法重復性較好。

加樣回收試驗：取已知含量的供試品溶液6份，每份0．1 mL，分為3組，分別精密加入0．503 0 g／L薯蕷皂苷對照品溶液0．1 mL，按顯色方法進行顯色，于406 nm波長處測定吸光度，計算回收率。結果平均回收率為99．04%，RSD為2．19%(n＝6)。

2．1．3 樣品含量測定

精密量取樣品溶液2 mL及對照品溶液，經高氯酸顯色，測定吸光度，以標準曲線法計算薯蕷總皂苷含量。

2．2 工藝考察

2．2．1 單因素試驗優化生物酶預處理盾葉薯蕷工藝

[12]，生物酶預處理過程中，溫度、pH、生物酶預處理水用量、酶用量、酶解時間是影響預處理效果的主要因素。本試驗以薯蕷總皂苷得率為指標，采用單因素試驗對上述因素進行考察，優選出最佳酶預處理條件。

酶解溫度：取盾葉薯蕷粉末6份，每份5 g，加一定量的水混勻，自然pH條件下，加適量復合生物酶混勻，分別置50，55，60，65，70，75℃恒溫培養箱中酶解24 h。進行后處理，升溫至100℃保持30 min，使酶滅活，酶解液離心，棄上清液，沉淀80℃烘干，研碎，得盾葉薯蕷酶解物。按盾葉薯蕷粉末質量∶乙醇溶液體積(1∶8)的料液比，在酶解物中加80%乙醇溶液，水浴回流提取2 h，離心，取上清液，沉淀重復提取1次，合并兩次上清液，定容至100 mL容量瓶中，搖勻，即得樣品溶液，按前文所述方法測定總皂苷含量，并求出總皂苷得率。由圖1可知，70℃以前薯蕷總皂苷得率隨酶解溫度的升高而增大，當溫度達70℃時得率達最大值，繼續升高溫度，得率降低，說明70℃時生物酶活性較高。

圖1 酶溫度對總皂苷得率的影響

酶解pH：取盾葉薯蕷粉末7份，每份5 g，加一定量的水混勻，分別調 pH至4．0，4．5，5．0，5．5，6．0，6．5，7．0，加適量復合生物酶混勻，置70℃恒溫培養箱中酶解24 h。按前文所述“后處理”方法制備樣品溶液，測定吸光度并計算得率。由圖2可知，pH為5．5以前薯蕷總皂苷得率隨pH的增大而增大，當pH為5．5～6．0時得率達最大值，繼續增大反應液pH，得率降低，說明pH為5．5～6．0時生物酶活性較高。

圖2 酶解pH對總皂苷得率的影響

生物酶預處理水用量：取盾葉薯蕷粉末6份，每份5 g，分別以4，6，8，10，12 L／kg的量加水混勻，調pH至5．5，加適量復合生物酶，混勻，置70℃恒溫培養箱中酶解24 h。按前文所述“后處理”方法制備樣品溶液，測定吸光度并計算得率。由圖3可知，生物酶預處理水用量在4～6 L／kg之間時薯蕷總皂苷得率相對較高，當超過6 L／kg時，繼續增大料液比，總皂苷得率降低，說明水用量在4～6 L／kg較為合適。

圖3 生物酶預處理水用量對總皂苷得率的影響

酶用量：取盾葉薯蕷粉末5份，每份5 g，以4 L／kg的量加水混勻，調 pH至 5．5，依次按照 2，4，8，12，16 mL／kg的量加復合生物酶，混勻，置70℃恒溫培養箱中酶解24 h。按前文所述“后處理”方法制備樣品溶液，測定吸光度并計算得率。由圖4可知，薯蕷總皂苷得率隨酶用量的增大而增大，當酶用量為8 mL／kg時總皂苷得率為8．64%，繼續增加酶用量，總皂苷得率增加不明顯，說明酶用量為8 mL／kg較為合適。

圖4 酶用量對總皂苷得率的影響

酶解時間：取盾葉薯蕷粉末5份，每份5 g，以4 L／kg的量加水混勻，調pH至5．5，按8 mL／kg的量加復合生物酶，混勻，置70℃恒溫培養箱中分別酶解6，12，24，36，48 h。按前文所述“后處理”方法制備樣品溶液，測定吸光度并計算得率。由圖5可知，薯蕷總皂苷得率隨酶解時間的延長而增大，當酶解時間為24 h時總皂苷得率為8．67%，繼續延長酶解時間，總皂苷得率無明顯增加，說明酶解24 h反應較為完全。

圖5 酶解時間對總皂苷得率的影響

工藝驗證：取盾葉薯蕷粉末3份，每份5 g，以1∶4的料液比加水混勻，調pH至5．5，按8 mL／kg的量加復合生物酶，混勻，置70℃恒溫培養箱中酶解24 h。按前文所述“后處理”方法制備樣品溶液，測定吸光度并計算得率。結果總皂苷平均得率為8．86%（n＝3），RSD為1．14%，表明該提取工藝穩定可靠。

2．2．2 正交試驗設計優化總皂苷提取工藝

因素水平選擇：參考相關文獻并結合預試驗結果發現[12]，提取過程中，料液比（因素A）、提取時間（因素B）、提取次數（因素C）、提取溶劑（因素D）是影響薯蕷總皂苷得率的主要因素。取經生物酶預處理后的盾葉薯蕷粉末9份，每份相當于5 g盾葉薯蕷，以薯蕷總皂苷的得率為指標，采用 L9（34）正交試驗表進行試驗，篩選出最佳提取條件。正交試驗因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表

試驗結果分析：由表2可知，上述4個因素對薯蕷總皂苷得率影響的大小順序為：提取次數（C）＞料液比（A）＞提取時間（B）＞提取溶劑（D）。方差分析結果顯示，因素C對得率有極顯著性影響，因素A對得率有顯著性影響，因素B和D對得率影響不具顯著性，結果見表3。

表2 正交試驗設計表及結果

表3 方差分析

最佳工藝條件：正交試驗優選的提取條件為A3B2C3D1。比較提取2次和提取3次，發現總皂苷得率增加幅度較小，結合生產實際，提取條件為A3B2C2D1可能更為合適，即料液比為1∶8，每次提取1．0 h，提取2次，溶劑為60%乙醇溶液。

驗證試驗：取盾葉薯蕷粉末6份，每份5 g，均分為A1，A2兩組，按4 L／kg的量加水混勻，調pH至5．5，以8 mL／kg的量加復合生物酶混勻，至70℃恒溫培養箱中酶解24 h，離心，棄上清液，得盾葉薯蕷酶解物。以1∶8的料液比加60%乙醇溶液，回流提取1．0 h，A1組提取2次，A2組提取3次，分別合并提取液，測定吸光度并計算得率。由表4可見，提取2次和提取3次對最終得率無顯著影響（P＞0．05），故總皂苷最佳提取工藝為A3B2C2D1。

表4 最佳工藝驗證試驗結果

3 討論

3．1 總皂苷得率顯著提高

經生物酶預處理后，薯蕷總皂苷得率與原有工藝相比大幅提高。文獻[3]報道的最優工藝條件下，薯蕷總皂苷得率為1．84%（18．4 mg／g），新工藝條件下薯蕷總皂苷得率為9．76%，得率約提高4．3倍。分析認為，盾葉薯蕷中大部分皂苷類成分被包裹在占其干重82．5%的淀粉和纖維素中[10]，不易被提取出來，生物酶預處理使處于緊密包裹中的皂苷類暴露出來，從而提高了總皂苷得率。

3．2 提取溶劑差異分析

本試驗中乙醇濃度考察結果與文獻報道存在較大差異。文獻[13]報道，不同體積分數的乙醇對總皂苷得率有顯著性影響(P＜0．05)，體積分數為80%時得率最大，而在相同因素同一水平下。本試驗結果顯示，乙醇濃度對總皂苷得率無顯著性影響(P＜0．01)。這可能與本試驗對盾葉薯蕷進行酶預處理有關，一方面酶預處理后總皂苷更容易被提取出來，一定范圍內的濃度變化對總皂苷得率無顯著性影響；另一方面可能是因為酶預處理所提取的皂苷類成分發生改變，一些緊密包裹在淀粉和纖維素中帶糖基多、水溶性大的皂苷被提取出來[14－15]，具體原因有待進一步研究。

3．3 提取次數選擇

通過驗證，將提取次數設定為2次。正交試驗極差分析結果顯示，提取次數對總皂苷得率影響較大，方差分析結果顯示提取次數對總皂苷得率有顯著性影響，但對正交試驗結果進一步比較發現，提取2次與提取3次相比 K值增加不明顯（K3－K2＝0．50）。結合生產實際，提取次數增加1次，能耗、提取溶劑、提取時間均會大幅增加，因此考慮將提取次數設定為2次。工藝驗證結果顯示，提取2次和提取3次薯蕷總皂苷得率無顯著性差異，故提取2次更為合理。

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Extraction Process of Enzyme Pretreatment M ethod for Extracting Total Saponins from Dioscorea

Yang Guangyi1,Lei Pan1,2,Du Shiming1,2,Hui Xiaona1,Ye Fang1,Zhang Chenning1,Wei Jinbao1
(1．Taihe Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine,Shiyan Hubei,China 442000; 2．Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan,Hubei,China 430065)

Objective To establish a highly efficient extraction method for the saponins extracted from dioscorea zingiberensis．M ethods Evaluated by the yield of the saponins,the 5 factors,namely temperature,pH,water consumption,dosage of enzyme and enzyme hydrolysis time in the process of enzyme pretreatment were optimized via single factor experiment,and the 4 factors,namely ethanol concentration, ratio of solid to liquid,extracted time and extraction degree in the saponins extracion process were optimized via orthogonal experiment．Results The best conditions in the enzyme pretreatment are as follows:the temperature for the enzyme was 70℃,pH 5．5,water consumption was 4 L／kg,dosage of enzyme was 8 mL／kg,enzyme hydrolysis time was 24 h;the best conditions in the saponins extracted process wereas follows:ethanol concentration 60%,ratioof solid toliquid 1:8,extraction time 1．0 h,extraction degree twice．Conclusion The optimal conditions can extract the saponins from dioscorea zingiberensis stably．

dioscorea;enzyme pretreatment;total saponins;extraction process

R284．1；R282．71；TQ461

A

1006－4931(2016)09－0008－05

楊光義，男，博士研究生，副教授，碩士研究生導師，研究方向為中藥資源開發和新藥研究，（電子信箱）ygy996＠163．com。

2016－01－10)

2013年湖北省科技支撐計劃（對外科技合作類）項目，項目編號：2013BHE017；2014年湖北省教育廳中青年創新團隊項目，項目編號：T201414。