別嘌呤醇引起發疹型藥疹8例及相關基因HLA-B*5801檢測

羅　陽，韓　悅，王寶璽，姚　煦，劉　軍

(南京大學醫學院附屬鼓樓醫院皮膚性病科，南京 210008)

別嘌呤醇是一種常用的治療高尿酸血癥、痛風、急性尿酸性腎病的藥物。隨著該藥在臨床上的應用，其引發藥物過敏的臨床報道多見。據文獻報道，此藥是一些嚴重皮膚不良反應(severe cutaneous adverse drug reactions,SCARs)，如藥物超敏反應綜合征(hypersensitivity syndrome,HSS)、Stevens-Johnson綜合征(Stevens-Johnson syndrome,SJS)和中毒性表皮壞死松解癥(toxic epidermal necrolysis,TEN)的常見致敏藥物[1]。近年來藥物遺傳學研究發現，一些藥物嚴重不良反應與HLA-B特定的基因型密切相關，如別嘌呤醇引起的SJS和TEN被證實與HLA-B*5801有著明顯的相關性[2]。在臺灣漢族人群中，別嘌呤醇引起的SJS/TEN患者攜帶HLA-B*5801基因型為100%，遠高于國際組織相容性工作組(International Histocompatibility Working Group，IHWG)在2010年報道的世界不同人種HLA-B*5801的平均攜帶率，其中非洲人2%～4%，白種人1%～6%，亞洲印度人3%～15%，華人8.8%～10.9%。相似的結果在我國、韓國和泰國等國家也陸續被證實[3]。但是，目前尚不明確別嘌呤醇引起的發疹型藥疹與此基因型的相關性。為此，對8例別嘌呤醇引起的發疹型藥疹患者進行HLA-B*5801基因型的檢測。

資料與方法

一般資料

本研究經過本院倫理委員會的批準。所有入組者均簽署知情同意書。共篩選別嘌呤醇引起的發疹型藥疹患者8例(A組)，其中男5例，女3例，臨床癥狀見圖1,排除其他藥物致敏的可能和排除與藥疹相似的其他疾病的皮疹。同時還篩選了30例服用別嘌呤醇未發生藥疹的痛風患者(B組)和120名健康體檢者(C組)。所有入組者均為漢族。

研究方法

DNA提?。翰杉疎DTA抗凝的新鮮抗凝血，用TIANamp Blood DNA Kit提取試劑盒提取全血DNA，測DNA純度和濃度，-20 ℃保存。

儀器與試劑：HLA-B*5801檢測試劑盒(臺灣Pharmigene，Inc.，PG-5801C- 024)；qPCR儀7300(美國Applied Biosystem)；凝膠電泳圖像分析系統(美國BIO-RAD GelDocTM XR+System)。

PCR反應：PCR反應體系分兩種：內參體系25 μl：陽性對照模板2 μl，2×PCR Master Mix 12.5 μl，10×內參檢測mix 2.5 μl，除酶H2O 8 μl；樣本基因型檢測體系25 μl：DNA 2 μl，2×PCR Master Mix 12.5 μl，10×內參檢測mix 2.5 μl，除酶H2O 8 μl。PCR反應程序：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，71 ℃退火/延伸1 min，共35個循環。

PCR擴增產物電泳檢測：配制2%的瓊脂糖凝膠，取PCR擴增產物7 μl進行電泳，采用凝膠電泳圖像分析系統分析結果。

結果分析：每個樣本有兩個Ct值，一個是基因型，一個是內參。Ct的差值計算：△Ct=Ct(基因型)-Ct(內參)。根據以下情況判定結果是否為陽性，如果Ct(內參)≤27,Ct(基因型)≤35，△Ct≤7，則HLA-B*5801陽性，△Ct>7則HLA-B*5801陰性;Ct(內參)≤27，Ct(基因型)>35(undetermined),則HLA-B*5801陰性；如果CT(內參)>27，可能存在PCR抑制劑，需重新檢測。

統計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行統計學處理?；蝾l率用相對數表示。因為有一組期望頻數小于1，故比較差異采用Fisher精確概率法，按α=0.05的水準進行假設檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。相關性分析采用比值比(odds ratio,OR)值卡方檢驗，計算組間的OR值及其95%CI、P值，根據總體OR值與1之間的差別來判定別嘌呤醇引起的發疹型藥疹與HLA-B*5801等位基因的相關性是否有統計學意義。

結　　果

所有病例內參全部擴增成功。各組標本的HLA-B*5801檢出結果見表1。根據HLA-B*5801檢測試劑盒的判定方法進行結果判讀。

別嘌呤醇引起發疹型藥疹患者HLA-B*5801等位基因陽性率與對照組差異比較

在別嘌呤醇引起發疹型藥疹的8例患者(A組)中，有3例患者HLA-B*5801陽性(表2)。對3例HLA-B*5801檢測陽性患者PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，內參擴增及樣本擴增全部成功，PCR產物大小正確(圖2)。進一步證實3例患者HLA-B*5801陽性。30例服用別嘌呤醇未發生藥疹的痛風患者(B組)中，有2例患者HLA-B*5801陽性。120名健康體檢者中，有13名體檢者HLA-B*5801陽性。采用卡方檢驗，χ2=4.931，P>0.05。

別嘌呤醇引起發疹型藥疹患者與HLA-B*5801的基因攜帶相關性比較

藥疹組與非藥疹組HLA-B*5801基因型陽性率的比值OR=8.400，95%CI1.107～63.735，P<0.05；藥疹組與健康體驗組的HLA-B*5801基因型陽性率OR=4.938，95%CI1.056～23.100，P<0.05?？梢哉J為該型藥疹與HLA-B*5801的基因型攜帶具有相關性。

表1　各組標本HLA-B*5801基因檢出情況

表2　別嘌呤醇引起發疹型藥疹患者PCR檢測結果

討　　論

藥物過敏是臨床常見問題，皮膚是主要受累器官。藥疹的臨床表現類型多種多樣，輕癥者以紅斑、丘疹為主，重癥者可以出現表皮松解和大皰。SJS和TEN屬于重癥藥疹，雖然發生率不高，但癥狀嚴重，死亡率高[4]。別嘌呤醇是治療痛風的常用藥物，該藥物引起的藥疹發生率大約為2%～5%[5- 6]。別嘌呤醇藥疹可分為重癥藥疹與非重癥藥疹兩類。其中非重癥藥疹包括：紅斑發疹型、多形紅斑型及紫癜型；重癥藥疹包括：重癥多形紅斑型、剝脫性皮炎型及TEN。其中發疹型藥疹占35%左右[7]。鑒于HLA分子在免疫反應中扮演著重要的角色，參與將藥物抗原呈遞給T細胞表面受體從而引發免疫反應，故HLA等位基因型別與藥物過敏的相關性成為藥物不良反應研究領域的熱點。1989年，Chan等[8]首次報道了HLA與別嘌呤醇引起不良反應相關性的研究。2005年Hung等[3]首次在臺灣漢族人群中發現別嘌呤醇引起的SJS/TEN與HLA-B*5801之間具有強相關性。隨后在韓國、泰國及日本患者中也證實了SJS/TEN與HLA-B*5801之間存在關聯性，但是關聯性要比Hung等[3]的研究弱得多[9-11]。

輕癥藥疹雖然臨床危害較小，但是反復多次發病后可向重型發展。很多重型藥疹發病初期僅表現為輕癥皮損，所以明確別嘌呤醇過敏的發疹型患者的HLA-B*5801基因型攜帶率，可能有助于判斷疾病預后和發生重癥藥疹的風險。雖然大量研究表明HLA-B*5801與重癥藥疹的強相關性，但是與輕癥藥疹的關聯還有待更多的臨床研究證據，并且不同種族間的關聯性也不相同，有必要進行我國人群此基因型與別嘌呤醇引發的輕癥藥疹間的相關性研究。本研究初步分析了HLA-B*5801基因型在別嘌呤醇引發的發疹型藥疹患者中的分布頻率，研究納入8例別嘌呤醇引起的發疹型藥疹患者，并以別嘌呤醇耐受的痛風患者和健康體檢者為對照。顯示8例患者中3例患者HLA-B*5801檢測陽性，陽性率為37.5%，與之前部分報道[12]相符。而對照組該基因型的分布頻率分別為6.7%和10.8%，雖然各組間比較差異沒有統計學意義(P>0.05)，但別嘌呤醇所致的發疹型藥疹與HLA-B*5801的基因型攜帶率具有相關性(OR=8.400，95%CI：1.107～63.735，P<0.05)，提示攜帶此基因型的別嘌呤醇所致的發疹型患者發展為重癥藥疹的風險可能高于非攜帶者。值得一提的是，本研究納入的3例HLA-B*5801檢測陽性發疹型藥疹患者中，1例患者由于不能停藥，在發疹型藥疹反復發作2年后，出現了SJS型藥疹。本研究納入的樣本數量偏少，還有待于擴大樣本量進行驗證。

(本文圖1、2見插頁Ⅰ)

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