“活的非可培養態”食源致病細菌的研究進展

谷立慧，鐘青萍，方祥，廖振林，王麗

(華南農業大學 食品學院，廣東 廣州，510642)

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“活的非可培養態”食源致病細菌的研究進展

谷立慧，鐘青萍，方祥，廖振林，王麗*

(華南農業大學 食品學院，廣東 廣州，510642)

摘要食源致病細菌是影響食品質量與安全的重要生物污染源。食品加工過程中的低溫、寡營養及食品防腐等條件可誘使食源致病細菌進入活的非可培養狀態(viable but non-culturable state, VBNC)，處于此狀態的細菌最大的特點就是喪失了平板上的生長繁殖能力，但生命體征是活的，并且保留原菌的毒力和致病性。研究表明，活的非可培養態細菌在細胞形態、基因表達、蛋白表達等方面發生了復雜變化，并且一定條件下可復蘇為可培養狀態，成為逃避檢測的“隱性傳染源”，對食品安全構成潛在威脅。文中對食源性致病菌VBNC態的誘導條件及復蘇情況、生物學特性變化、現代檢測技術的發展等方面的研究進行了綜述。期望為解決當下由活的非可培養態細菌引起的食品安全問題提供理論參考。

關鍵詞食源致病細菌；活的非可培養態；食品安全；生物學特性

據WHO(World Health Organization)統計，每年全球大約有15億腹瀉病人，其中因食用微生物污染的食品引起的約占70%[1]。美國CDC(Centers for Disease Control)估計，美國每年由食源性致病菌引起的疾病約有7 600萬例，導致死亡的病例不在少數[2]。在食品加工過程中，如何殺滅食品中的致病菌、控制其數量以及防止其污染，一直都是食品生產者十分關心的問題。如何采取簡便易行的有效方法檢測食品中的致病菌種類和數量，也一直是食品質量監管部門努力的方向。然而，食源性致病菌活的非可培養狀態的存在給食品安全監控工作帶來了新的挑戰。VBNC細菌是細菌在不良環境下的一種存活狀態，用常規的培養法不能檢出，在實際檢測中容易造成漏檢。尤其是進入活的非可培養狀態的致病菌，這些致病菌在適宜的條件下又可以恢復到正常狀態，對食品安全、人類健康帶來了潛在的威脅。自1982年VBNC態細菌被發現起，科研工作者對VBNC態細菌的研究，尤其是VBNC態致病菌的研究不斷深入，取得了一定的進展。本文從食源性致病菌VBNC態誘導條件、生物學特性變化、檢測技術的發展以及復蘇情況等方面對VBNC食源細菌的研究現狀進行綜述，以期對解決與VBNC細菌相關的食品安全、食品衛生等問題提供理論參考。

1食源性致病菌VBNC態的誘導

VBNC態是細菌應對環境壓力的一種反應機制，因此許多不利于致病菌生長繁殖的條件都可能誘導致病菌進入VBNC態。在食品加工和貯藏過程中，如向食品中添加茶多酚、山梨酸鉀等防腐劑或將食品低溫貯藏等，均有可能誘導致病菌進入VBNC態。

低溫是最重要的誘導因素，同時寡營養作為協同因素。Masmoudi研究發現，4 ℃和寡營養條件下金黃色葡萄球菌快速進入VBNC態，而20 ℃和寡營養條件下細菌僅進入一種饑餓狀態[3]；郭川也用寡營養協同4 ℃低溫誘導出VBNC態副溶血性弧菌[4]。黃韻等人的研究也證明，單增李斯特菌在2 ℃和pH 6.0下比在25 ℃和pH 6.0下更早進入了VBNC狀態[5]。

此外，Alan等人的實驗表明，光照也有利于幽門螺桿菌進入VBNC狀態[6]。添加金屬離子、有機物等是誘導致病菌進入VBNC態的另一重要因素。Monica等人通過添加一定濃度的銅離子誘導出VBNC態梨火疫病菌[7]。陳穎翹等人通過添加防腐劑山梨酸鉀誘導出VBNC態金黃色葡萄球菌[8]。

另外，能誘導致病菌進入VBNC態的方法還有很多，如通過控制氧濃度、與真核微生物共培養等；值得一提的是，同種細菌的不同菌株的誘導條件不全相同。由于加工過程和貯藏過程中許多條件都可能無意中促使食品中的致病菌進入VBNC態，因此，人們應關注VBNC態致病菌的生長代謝情況、致病性以及VBNC態細菌檢測技術的發展。

2VBNC態致病菌生物學特性的變化

活的非可培養態食源細菌在生物學特性上發生了很大的變化，尤其在細胞形態、基因表達和蛋白質表達方面，這是食源細菌為了適應外在食品加工環境而做的自我生理調整的結果。

2.1細胞外在形體變化

VBNC態致病菌形態發生改變，這可能與致病菌應對環境壓力做出的形態調整相關。許多研究表明，致病菌進入VBNC態后，細胞結構沒有改變，但細菌形態發生了變化，多數體積縮小成球形或不規則球形；細胞間質變大[9]；時間越長，形態發生改變的細胞比例越多[10-11]；菌形態受不同環境因素(如NaCl濃度、抗生素存在與否等)的影響不同[12]。許多VBNC態致病菌菌體較正常態的密集[13-14]，且細胞間密度增大，但也有的菌體較分散[8]。另外，VBNC態致病菌抗機械阻力增強[15]。

2.2細胞壁和細胞質的變化

有研究發現[16-17]，VBNC態細菌細胞壁變得松散、有彈性、有褶皺和凸起，細胞壁增厚，耐受性改變，如提高了對熱、過氧化氫和低濃度鹽的耐受性，但對膽汁鹽變得敏感。FALCIONI[18]等人也發現，VBNC態副溶血性弧菌與特異性抗體的結合能力下降，說明細胞表面抗原的成分和數量可能發生改變。TREVORS[19]等人檢測到VBNC霍亂弧菌細胞質密度增加，總的細胞脂質、碳水化合物、聚-β-羥丁酸(poly-β-hydroxybutyrate,PHB)的量減少，可能是饑餓狀態下細菌在利用這些物質供能。

2.3核酸和蛋白質的變化

目前人們對食源性致病菌VBNC態的研究已經深入到分子水平，VBNC態致病菌蛋白質合成和基因的表達是人們研究的一個重點。

VBNC態致病菌的蛋白質含量和種類都有所變化。LAI[20]檢測到VBNC副溶血性弧菌中13種蛋白質含量增加，其中有與轉錄、翻譯、ATP合成、糖異生作用等相關的酶，還有一些未知功能的酶類。Pawlowski[9]的研究也發現VBNC鼠疫桿菌能吸收和整合放射性的氨基酸。這都表明，VBNC態細菌的生命活動還在持續進行。

但從總體來看，VBNC態致病菌代謝強度是減弱的，且維持在VBNC態時間過長，細菌會逐漸走向死亡。ZHAO[15]檢測到VBNC態大腸桿菌的總體酶活力比可培養態的弱；潘樂[21]發現提取的VBNC態沙門氏菌和大腸桿菌mRNA濃度均小于可培養態；TREVORS[19]檢測到霍亂弧菌DNA、RNA和蛋白質的含量也在下降，當DNA含量下降到一個閾值時，VBNC態將不可復蘇，逐漸走向死亡。

值得注意的是，致病菌VBNC態仍然保留其致病基因，且仍能表達，從而表現出致病性。劉靜宇[22]檢測到VBNC態副溶血性弧菌毒力基因tdh2的表達；PATRONE[11]檢測到VBNC態空腸彎曲桿菌CadF蛋白的表達，證實其仍有粘附在腸道黏膜的能力。另外，研究者們也發現了食源性致病菌某些基因對其進入、維持VBNC態以及復蘇到可培養態有非常重要的意義，如AhpC基因、VP2468基因、過氧化氫酶和超過氧化物歧化酶基因等[3,10,23]；還有發現VBNC態致病菌增加了某些基因[10]，這可能是細菌在進入VBNC態時，發生了變異以應對環境壓力。

3VBNC態致病菌的檢測方法

從目前研究來看，食源性致病菌進入VBNC態對食品的衛生與安全存在著不容忽視的威脅，因此針對VBNC態致病菌，發展有效的檢測方法是目前研究中非常嚴峻且重要的任務?，F階段，用于VBNC態致病菌的檢測方法有很多，常用的方法主要有：吖啶橙熒光顯微鏡直接計數法(acridine orange direct count, AODC)、活菌直接計數法(direct viable count, DVC)、平板計數法(plate count, PC)、死/活細菌檢測試劑盒(LIVE/DEAD baclight bacterial viability kit )、流式細胞儀、免疫學法以及分子生物學法等。

3.1經典方法

經典方法即吖啶橙熒光顯微鏡直接計數法、活菌直接計數法及平板計數法三者結合法，一直沿用至今[4]。AODC法原理是吖啶橙與RNA或單螺旋DNA結合發出紅色熒光，與雙螺旋DNA結合發出綠色熒光，通過顯微鏡觀察直接計數。影響熒光顏色的因素眾多，如細菌狀態、吖啶橙濃度、PH值等，因此AODC法用于檢測總菌數。DVC法是將DNA抑制劑萘啶酮酸和酵母浸膏加到細菌培養物中，培養6h固定后用吖啶橙染色。VBNC態細菌DNA合成受到抑制而不分裂，但能吸收營養而生長，該法能檢出具有代謝活性的活菌數。但多數G+菌和少數G-菌對萘啶酮酸產生抗性，因此，有研究用環丙沙星代替萘啶酮酸，取得較好的結果[14,24]。

3.2LIVE/DEAD 試劑盒

LIVE/DEAD試劑盒由兩種專染核酸的染料組成，一種是能滲入具有完整細胞膜結構的綠色熒光染料SYTO-9，一種是僅能滲到細胞膜破損的菌體內且與SYTO-9競爭核酸著染位點，削弱綠色熒光的紅色染料碘化丙錠PI。此法染色后，活菌呈現綠色，死菌呈現紅色。該方法的優點是操作簡便、省時，使用廣泛，缺點是無法對其中的細菌種類進行鑒別，且各類染料存在強烈的致癌作用，并且價格較高[5]。

3.3流式細胞儀

細菌細胞群具有生理階段的不均一性，因此細菌在特殊儀器中可產生不同動力，從而實現流式細胞儀對細胞或亞細胞結構進行快速測量，且能進行定量分析。該方法優點是能夠通過流式圖顯示顆粒分散程度和位置，明顯地對VBNC態細菌進行識別，流式細胞儀與熒光染料聯合運用可客觀評價細菌活性狀態，在死活細菌的數量和兩者數量比例關系上進行比較準確的分析[18,25]。缺點是，無法鑒定是具體哪一種類的微生物[26]，分析樣品時所需熒光染料劑量比較大，成本較高。

3.4免疫技術

免疫學方法應用的原理是活的VBNC態細菌仍具有抗原性，且能與其特異性抗體結合。劉光明[27]等人使用抗血清和磁性微珠制備彎曲菌免疫磁珠，建立IMC-FPCR檢測方法，該方法靈敏度高、選擇性好、簡便，可在24 h 內完成對VBNC態空腸彎曲菌的檢測。郭川[4]等人用抗血清捕獲菌體后對其tlh基因進行PCR擴增，檢測到VBNC副溶血性弧菌。但是，許多VBNC態致病菌形態發生變化，如皺縮、體積縮小等，有的表面與特異性抗體結合的能力下降[18]，因此，免疫檢測法的準確性受到 VBNC態致病菌本身的干擾。

3.5分子生物學方法

VBNC態致病菌的檢測方法還有很多，如呼吸檢測法、ATP含量檢測法、放射自顯影法以及GFP基因檢測法等，多數是根據致病菌的代謝產物來進行檢測。然而，由于VBNC態致病菌生物學特性變化多樣，以上方法均有一定的局限性。目前研究最多的是分子生物學檢測方法，該方法具有特異性強、檢測限低、快速便捷等優點，是將來最有可能有效應用于VBNC態食源性致病菌檢測的方法。

細胞內的mRNA不穩定，易被核酸酶快速降解，是活細胞的信號分子，因此利用逆轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription and polymerase chain reaction，RT-PCR)技術直接檢測mRNA是目前公認的比較適合的標準之一。RT-PCR檢測技術被廣泛用于VBNC的空腸彎曲桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌等致病菌的檢測[11,28]。

逆轉錄實時熒光定量PCR(reverse transcription and real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光積累實時監測整個PCR進程，通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。具有特異性強、靈敏度高的特點，能有效解決PCR交叉污染問題。潘樂[21]建立了VBNC態的大腸桿菌和沙門氏菌的RT-qPCR檢測方法，該方法敏感性、特異性和重復性均很理想。劉靜宇用RT-qPCR檢測VBNC副溶血性弧菌，鑒定基因toxR 的最低檢測限可達到48CFU/mL[20]。

EMA/PMA-qPCR技術是基于活菌細胞膜完整性來檢測VBNC細菌的。EMA(ethidium monoazide,疊氮溴乙錠)和PMA(propidium monoazide,疊氮溴化丙錠)是DNA染料，能穿透死細胞的細胞膜并與其DNA共價交聯形成沉淀，在提取細菌DNA時死菌能被除去，阻止死細胞DNA擴增。田聰、Dinu用PMA-qPCR檢測VBNC態大腸桿菌，檢測限分別可達到100 CFU/mL和1 000 CFU/mL[14,29]；黃韻等[5]用PMA-qPCR檢測蔬菜樣品中的VBNC單增李斯特菌，檢測限為1 000 CFU/g蔬菜葉子。

環介導等溫擴增法(loop-mediated isothermal amplification , LAMP)不需要模板的熱變性、溫度循環及熒光顯微鏡觀察等過程，因此不需要昂貴的實時熒光PCR儀，且具有簡單、快速、特異性強、高靈敏度等特點。WANG[30-31]等人用EMP-LAMP技術檢測VBNC態副溶血性弧菌，且對比發現，EMA-LAMP檢測技術的檢測靈敏度遠高于EMA-PCR檢測技術。

4VBNC態致病菌的復蘇

VBNC態致病菌雖仍能表達致病基因，但更令人擔心的是其復蘇到可培養態后，在食品中生長繁殖，從而使食品敗壞或使人致病。目前許多研究發現，通過升溫的方法可以有效地使VBNC態致病菌復蘇[3,32]。因此推測，若在食品低溫貯藏期內進入VBNC態的致病菌，在常溫解凍、銷售、儲運過程中有可能復蘇為可培養態。

目前研究結果表明，通過添加促使復蘇的化學物質以及與真核細胞共培養可使VBNC致病菌復蘇。曹小紅等通過添加吐溫20、過氧化氫酶等使VBNC態大腸桿菌和金黃色葡萄球菌復蘇[16]；Yuta等通過添加丙酮酸鹽、α-酮丁酸等使VBNC態沙門氏菌復蘇[33]。另外，添加的有機物可以激活細胞，促使DNA的表達和蛋白質的合成，從而促進復蘇。Mitsutoshi將VBNC態霍亂弧菌與多種真核細胞共培養使其復蘇，且在真核細胞提取物中發現并命名了PCVC復蘇因子[34]，并提出，PCVC復蘇因子和Rpf將是研究VBNC態細菌復蘇的一個重要方向。

由于不同的食源性致病菌對生長環境條件的要求不同，因此不同致病菌的復蘇條件不同。值得關注的是，并非所有VBNC態致病菌都能復蘇。當致病菌處于VBNC態時間過長，或丟失了某些基因，如過氧化氫酶基因缺陷，則VBNC態致病菌不可復蘇，這為消除VBNC態致病菌提供了方向。

5展望

當今食品安全問題是國人關注的熱點問題，而VBNC態食源致病菌的存在無疑是對食品安全和人們健康有著不可估量的潛在威脅。到目前為止，報道的VBNC態細菌的種類已經多達70多種，其中VBNC態的金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、沙門氏菌、單增李斯特菌等常見致病菌比較多見，人們對其存活機理及檢測技術的研究也已經深入到基因分子水平。

食源性VBNC態致病菌的存在，向食品企業和食品質量監管部門提出了新的挑戰。如何優化工藝條件以防止食源性致病菌在食品加工過程中進入VBNC態，以及如何殺滅VBNC態致病菌或阻止其復蘇，將是食品生產企業急需解決的問題，另外，如何改進目前的分子生物學檢測技術，使其更快速、便捷、有效和低成本，將是食品企業和食品質量監管部門共同面臨的問題，也是目前研究的方向。

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Research progress on the viable but non-culturable state of food-borne pathogenic bacteria

GU Li-hui, ZHONG Qing-ping, FANG Xiang, LIAO Zhen-lin, WANG Li

(College of Food Science,South China Agricultural University，Guangzhou 510642,China)

ABSTRACTThe food-borne pathogenic bacteria are the important source of biological pollution, which influence the food quality and safety. Low temperature, poor nutrition and food preservation can induce the food-borne pathogenic bacteria into VBNC. At this state, these bacteria characterized in that they are no longer able to grow and form colonies on culture media , but their vital signs are still alive and their virulence is maintained. Studies showed that the bacteria at VBNC state were complicated changed in morphology, gene and protein expression and could regain to be culturable. It might become latent infection escaping detection to threaten food safety. Researches on inducing condition and resuscitation, biological characteristic change and the development of detection technology of food-borne pathogenic are summarized in this paper, which may provide theory basis for the study on food safety problem caused by the VBNC state of bacteria.

Key wordsfood-borne pathogenic; VBNC; food safety; biological characteristic

收稿日期：2015-06-18，改回日期：2015-08-07

基金項目：國家自然科學基金：食品防腐環境下食源細菌應激進入活的非可培養狀態的機制研究(31000781);基于PPAR通路的A型原花青素腸道菌群代謝物抗動脈粥樣硬化用與機制研究(31471705);基于組學的副溶血弧菌"活的非可培養狀態"的分子機理研究(31271956);國產高純度天然右旋龍腦規?；a關鍵技術研究(2012B091100075)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602046

第一作者：碩士研究生(王麗為通訊作者，E-mail:wangli_scau@sacu.edu.cn)。