腺病毒Smad 7轉染對阿霉素腎病大鼠蛋白尿的影響

馮笑琪，林娜娜，謝燕媚，紀澤泉（廣州醫科大學附屬第二醫院，廣東廣州510260）

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腺病毒Smad 7轉染對阿霉素腎病大鼠蛋白尿的影響

馮笑琪，林娜娜，謝燕媚，紀澤泉
（廣州醫科大學附屬第二醫院，廣東廣州510260）

摘要：目的在阿霉素（ADR）腎病大鼠模型中，探討過表達Smad 7對腎病蛋白尿及其病理的影響。方法本實驗用單次尾靜脈注射建立阿霉素腎病模型，通過構建重組腺病毒介導外源性Smad 7基因，單側腎動脈灌注轉染Smad 7至靶腎臟。用熒光顯微鏡檢測Smad 7重組腺病毒的轉染效果，用鄰苯三酚紅比色法測定大鼠24 h尿蛋白，HE染色檢測各組腎臟病理改變。結果①用6.5 mg/kg ADR一次性尾靜脈注射SD大鼠可成功構建腎病模型；4周末似微小病變型腎病。②單側腎動脈灌注能有效將介導Smad 7的重組腺病毒轉染至大鼠靶腎臟。③4周末腎病重組腺病毒（Ad-Smad7）組尿蛋白（38.4±6.0）較ADR組（69.58±10.63）減少（P<0.05）。④熒光顯微鏡顯示腎病Ad-smad7組大鼠靶腎中，Ad-Smad7主要在腎小管表達，腎小球表達少。⑤腎病Ad-Smad7組腎臟病理改變輕微，腎病Ad-GFP組、ADR組病理較嚴重，出現類似局灶節段性腎小球硬化的慢性腎臟病病理表現。結論單側腎動脈灌注有效地使重組腺病毒介導的Smad 7轉染至大鼠靶腎臟，使Smad 7在該腎過表達，可減輕腎病大鼠蛋白尿，并改善阿霉素腎病病理。

關鍵詞：重組腺病毒；Smad 7；腎??；蛋白尿

腎纖維化包括腎小球硬化和腎小管間質纖維化，是各種慢性腎臟病的共同病理過程。TGF-β/Smads信號通路是目前公認的主要通路之一，其下游的Smad 7起負反饋調節作用。在動物實驗中，應用通用的大鼠模型，大鼠阿霉素腎病各階段病理與人的微小病變型腎病、局灶節段性腎小球硬化相似[1]，有助于進一步研究TGF-β/Smads通路的機制。腎小球上皮細胞及腎小管細胞對蛋白有選擇性濾過作用，所以阿霉素腎病的蛋白尿不僅反映腎病病程發展，也提示其病理情況。前期細胞實驗表明，系膜細胞中過表達Smad 7可抑制AngII誘導的系膜細胞增殖及炎癥反應[2]。本實驗用大鼠阿霉素腎病模型，構建重組腺病毒（adenovirus）介導外源性Smad 7基因，通過從腹主動脈向單側腎動脈灌注，阻斷遠心端、近心端血流，腎動脈灌注將外源性Smad 7轉染至靶腎臟[3]，驗證靶腎過表達Smad 7對抑制大鼠蛋白尿，改善腎病病理變化的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物與材料

采用Spragoe-Dawleg（SD）系雄性大鼠，SPF級，購買于廣東省醫學實驗動物中心。動物實驗在廣州醫科大學實驗動物中心進行，注冊編號為SYXK（粵）2010-0104。鹽酸阿霉素（adriamycin，ADR），為深圳萬樂藥業有限公司產品，批號H44024359。重組腺病毒（Ad-Smad7、Ad-GFP）購買于漢恒生物科技有限公司。大鼠手術器械一套、10%水合氯醛、40單位胰島素針（美國BD公司）等。

1.2模型的建立及分組

隨機取40只大鼠，體重150～180 g。ADR腎病模型一次性尾靜脈注射ADR 6.5 mg/kg，注射后1、4 及10周末檢測24 h尿蛋白，模型組尿蛋白與正常對照組之間差異有統計學意義，出現病理學改變證明模型構建成功。實驗分正常對照組（Con組）、ADR腎病組（ADR組）、ADR腎病+Ad-Smad7組（腎病Ad-Smad7組）、腎病+Ad-GFP組（腎病Ad-GFP組）和ADR腎病+假手術組(腎病sham 組)，每組8只。ADR注射1周末，腎病Ad-Smad7組通過夾閉腹主動脈近心端、遠心端，由腹主動脈向單側腎動脈灌注Ad-Smad7；同法建立腎病Ad-GFP組；腎病sham組開腹后相同時間內單純夾閉腹主動脈；Con組尾靜脈注射等容積的生理鹽水。

1.3觀察指標及檢測方法

1.3.1腎病模型的尿生化檢測ADR注射后1、4 及10周末用代謝籠分別收集24 h尿液，記錄24 h尿量，3 000 r/min離心5 min后暫存于4℃冰箱，用鄰苯三酚紅比色法檢測24 h尿蛋白。

1.3.2構建腎病Ad-Smad7組、腎病Ad-GFP組及腎病sham組在ADR注射1周末，每組隨機選取8只模型鼠，術前1天禁食不禁飲。按4 ml/kg水合氯醛麻醉，作倒T字開口，逐層開腹，找左腎部位，分離左腎靜脈，顯露術野后，找到下腔靜脈與腹主動脈，分別游離出下腔靜脈和腹主動脈。細絲線分別游離腹主動脈近心、遠心端。備好重組腺病毒，胰島素針。分別用動脈夾夾閉游離好的腹主動脈近心端及遠心端，將5×109pfu/ml重組腺病毒（Ad-Smad7/Ad-GFP）均速地從腹主動脈灌注入左腎動脈，灌注完立即退針，按壓約5min。按壓同時稍提起左腎靜脈絲線，短暫阻斷左腎血流，延長腺病毒與該腎的接觸時間。阻斷血流注射病毒總時間控制在10 min以內。確認清理干凈后關腹，肌肉層連續縫合，皮膚間斷縫合。連續肌注10萬u青霉素3 d，放回籠里保暖。

1.3.3腎臟標本采集Con組和ADR組分別于ADR注射后4周末及10周末取腎，腎病Ad-Smad7組、腎病Ad-GFP組、腎病sham組于4周末取腎。切取腎臟后剝離腎包膜，部分腎組織置于4%多聚甲醛做冷凍切片熒光檢測，部分腎皮質置于10%甲醛做病理檢查，HE染色；其余腎組織置于液氮保存。

1.3.4冷凍切片熒光顯微鏡檢測Ad-Smad7 4%多聚甲醛固定的腎組織過夜，蔗糖溶液脫水，直至腎組織沉降到容器底部。預冷冷凍切片機，溫度調至-22℃，切片厚度為45μm。按需要切取適量腎組織，加PBS泡于6孔板中。病理級玻片預先過明膠，以防脫片。每張玻片用抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.3.5HE染色切片在二甲苯中脫蠟；依次放入100%、95%、85%、70%酒精，各級為2～5 min。最后經蒸餾水轉入染液；蘇木精染液染色10 min；水洗玻片上多余染液，0.5%～1.0%鹽酸酒精（70%酒精配制）分色片刻。鏡檢控制，直至細胞核及核內染色質清晰為止；流水沖洗，或在碳酸鋰飽和液中短時間堿化，蒸餾水短洗；0.1%~0.5%伊紅染液染色1～5 min；依次經70%、85%、95%、100%酒精脫水；二甲苯透明（2次），共約10 min；迅速滴加適量中性樹膠，加蓋玻片封固。

1.4統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。計量資料用均數±標準差（±s）表示，組間兩兩比較采用LSD法檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1阿霉素腎病模型24 h尿蛋白檢測

分別取Con組、ADR組1周末、4周末、10周末24 h尿，ADR組1周末24 h尿蛋白升高，4周末升至較高水平，與同時間點Con組比較顯著升高，模型構建成功；4周末ADR組與1周末ADR組比較顯著升高。10周末稍降低，但仍較同時間點Con組高。Con組各時間點尿蛋白差異無統計學意義，見圖1。

2.2正常對照組與模型組病理檢測

Con組腎小球內皮、毛細血管清晰，血管球與腎球囊無黏連（見圖2A）；ADR組腎小球系膜基質增多，毛細血管腔狹窄或破壞，毛細血管叢與囊壁黏連（見圖2B）。

2.34周末各組大鼠尿蛋白比較

ADR注射4周末，與Con組比較，ADR組24 h尿蛋白顯著升高。與ADR組比較，Ad-Smad7轉染后大鼠24 h尿蛋白減少，差異有統計學意義；與腎病Ad-GFP組、腎病sham組比較，腎病Ad-Smad7組大鼠24 h尿蛋白也減少，差異有統計學意義。ADR組、腎病Ad-GFP組、腎病sham 3組尿蛋白比較差異無統計學意義。見圖3。

2.4各組腎組織冷凍切片熒光鏡檢

腎病Ad-GFP組的熒光鏡檢可見腎小管上皮細胞有綠色熒光，表明腺病毒已轉染至小管上皮細胞。與Con組、ADR組比較，Ad-Smad7在5×109pfu/ml時轉染效果明顯，而腎病sham組與ADR組相似，僅有輕微均勻的自發熒光。見圖4。

圖1　Con組、ADR組各時間點24 h尿蛋白

圖2　Con組、ADR組4周HE染色病理圖（×400）

圖3　4周末各組大鼠24 h尿蛋白比較

圖4　腎臟冷凍切片熒光鏡檢Ad-Smad7（×400）

2.5各組大鼠腎臟病理改變

Con組見腎小球系膜細胞、毛細血管清晰，血管球與腎球囊無黏連；與Con組比較，ADR組腎小球系膜基質增多，毛細血管腔狹窄或破壞，毛細血管叢與囊壁黏連，部分腎小球有新月體形成；腎病Ad-GFP組腎小球球囊變形，毛細血管球萎縮，部分血管腔閉塞，腎小管上皮細胞腫脹，排列紊亂，部分脫失；腎病sham組腎小球毛細血管成分葉狀，系膜細胞增殖，與ADR組相似；腎病Ad-Smad7組血管球和腎球囊結構分明，內皮細胞、系膜細胞均勻分布，較ADR組病理改變減輕。見圖5。

圖5　各組腎臟病理HE染色（×400）

3　討論

腎組織纖維化和炎癥是慢性腎臟病病理過程，可發展為腎小球硬化。各種致病因素長期持續刺激腎小球，使內皮細胞受損，血管塌陷，系膜細胞增殖，細胞外基質（ECM）堆積，導致腎小球硬化。多條信號通路參與腎小球硬化過程，包括TGF-β/Smad信號通路，MAPK通路，Wnt通路等。其中Smad2、3、4、7 為TGF-β1的下游效應蛋白，Smad7為負反饋調節蛋白。有研究顯示細胞內Smad7的水平是決定TGF-β1反應性的主要因素，它通過干擾TβRⅠ型受體對Smad2、Smad3蛋白的磷酸化,或招募E3泛素連接酶（如Smurf1/2）導致活化的TβRⅠ型受體泛素化標記，對TGF-β1/Smad通路起負反饋調節作用[4-5]。

本研究前期在AngII刺激腎小球系膜細胞（glomerular mesangial cell，GMC）增殖的研究表明，Smad 7通過抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生，抑制AngII對NF-κB的激活，增加IκBα的蛋白表達并使核內表達增多，促進GMC凋亡，緩解其增殖。梗阻性腎病大鼠及細胞實驗均發現，過表達Smad 7后miR29b重新表達，Smad 7能抑制糖化終產物和AngII引起的microRNAs的表達，阻斷腎硬化的發展[6]。Chung等[7]的研究表明，過表達Smad 7可抑制糖化終產物誘導的Smad 3磷酸化，提示過表達Smad 7可作為糖尿病腎病治療的靶點。本實驗通過腺病毒介導Smad 7基因轉染腎病大鼠，觀察Smad 7干預后對模型大鼠蛋白尿及腎病病理的影響。

阿霉素作為一種蒽環類抗腫瘤抗生素，具有強烈的細胞毒作用，直接損傷腎臟細胞。它的醌式結構，在腎內代謝還原成半醌式自由基，后者與氧結合產生ROS，促使腎小管上皮細胞脂質過氧化，濾過膜結構、功能受損，產生蛋白尿。此外阿霉素還有心臟毒性、胃腸道反應等副作用，劑量過大會造成動物死亡，存活率降低[8-9]。因此，經過預實驗，本研究采用一次性尾靜脈注射6.5 mg/kg ADR的給藥方式，減少藥物血管外滲的機會，也減輕胃腸道反應。24 h蛋白尿檢測結果顯示，ADR組大鼠于阿霉素注射1周末即出現蛋白尿。研究顯示基因表達在大鼠腎臟可持續約3周[10]，所以本實驗從ADR注射1周末開始轉染Smad 7重組腺病毒，4周末檢測轉染效果。

腺病毒介導外源性基因轉染至大鼠腎臟定向表達的研究表明，腺病毒的感染效率高，用包裝細胞進行擴增，一次包裝所得的滴度較高（純化后為1011pfu/ml），純化后的腺病毒可直接進行動物活體注射[11]，因此，本實驗用腺病毒為載體介導Smad 7基因對阿霉素腎病大鼠進行干預。關于腺病毒活體注射的研究顯示，不同的注射方式感染率有明顯差異。單純靜脈注射通過血循環可使腺病毒經過腎臟，但病毒會同時感染多個器官，到達腎臟的腺病毒減少。為了使病毒感染大鼠并具有腎臟靶向性，實驗人員通過直接將重組腺病毒由腹主動脈向左側腎動脈灌注，暫時阻斷腹主動脈遠心端、近心端血流（近心端至右腎動脈下方，遠心端至左腎動脈下方），在兩者間進針即可使腺病毒灌注至左腎，并適當延長灌注時間[3，12]。

各組大鼠腎臟冰凍切片的熒光顯微鏡檢結果顯示，Con組、ADR組僅有輕微均勻的自發熒光，與前兩者比較，腎病Ad-Smad7和腎病Ad-GFP均見陽性表達區，Ad-Smad7組位于腎小管上皮細胞及小管間質，Ad-GFP主要位于腎小管上皮細胞。實驗表明5×109pfu/ml時轉染效果最明顯，且不引起大鼠過早死亡。腎病sham組與ADR組相似，僅有輕微均一的自發熒光。由此可見介導Smad 7的腺病毒已成功轉染至大鼠靶腎臟。

腺病毒介導基因轉染至大鼠的研究顯示，基因表達在大鼠腎臟內可持續約3周。灌注重組腺病毒Smad7后，即實驗4周末，腎病Ad-Smad7組24 h尿蛋白與ADR組、腎病Ad-GFP組、腎病sham組比較明顯減少，提示過表達Smad 7基因可抑制腎病蛋白尿。Liu等[13]研究表明，小鼠高血壓腎病模型通過非侵入的超聲微泡技術，強力霉素誘導Smad 7表達的質粒注入到腎臟后顯示，Smad 7提前干預能防止AngII引起的進行性腎損傷，抑制蛋白尿和血肌酐的增高。Wang[14]等研究顯示通過下調Smad7蛋白，過表達的miR21能促進糖尿病腎病中TGF-β1誘導的腎硬化。有腎病模型研究發現小管間質損傷和腎小球病變一樣決定著慢性腎臟病的進展，但其機制仍未十分清楚,如腎大部分切除模型、Heymann腎炎，他們實驗表明持續的蛋白尿與腎小管損傷密切相關[15]。而本實驗中Smad 7也正是在腎小管上皮細胞表達，可能Smad 7通過小管上皮細胞抑制TGF-β/Smad通路，從而抑制阿霉素腎病的進展，減輕腎病蛋白尿。

實驗檢測各組腎病大鼠腎臟病理改變，Con組見腎小球系膜細胞、毛細血管清晰，血管球與腎球囊無黏連；與Con組比較，ADR組腎小球系膜基質增多，毛細血管腔狹窄或破壞，毛細血管叢與囊壁黏連，個別腎小球有新月體形成；腎病Ad-GFP組與ADR組相似，毛細血管球萎縮，腎小管上皮細胞腫脹，排列紊亂，球囊黏連；腎病sham組腎小球毛細血管成分葉狀，系膜細胞增殖；腎病Ad-Smad7組血管球和腎球囊結構較分明，內皮細胞、系膜細胞分布較均勻，與ADR組比較有明顯減輕?？梢?，過表達Smad 7可緩解阿霉素腎病病理損害。

本實驗顯示Smad 7重組腺病毒通過腹主動脈定向灌注大鼠腎臟，使Smad 7在靶腎過表達，可減輕阿霉素腎病大鼠蛋白尿及改善腎臟病理情況，表明Smad 7可作為干預靶點，為腎硬化的防治提供新的實驗依據。

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（張蕾編輯）

Effect of adenovirus-mediated Smad7 gene transfer on proteinuria of Adriamycin-induced nephropathy rat model

Xiao-qi Feng,Na-na Lin,Yan-mei Xie,Ze-quan Ji
(The Second Affiliated Hospital,Guangzhou Medical University,Guangzhou,Guangdong 510260,China)

Abstract:Ojective To investigate the effect of overexpression of Smad7 on proteinuria and renal pathology in the Adriamycin-induced nephropathy (ADN) rat model.Methods ADN model was established by single tail intravenous injection of Adriamycin (ADR).Smad7 gene was transferred by means of infusing a recombinant adenovirus into the left renal artery.Recombinant adenovirus-Smad7 (Ad-Smad7) was detected under fluorescence microscope.HE staining was used to examine renal pathological changes of each group.Pyrogallol red colorimetry was used to detect 24-h urinary protein.Results SD rats received a single intravenous injection of ADR (6.5 mg/kg),which constructed the ADN model.The pathology was similar to minimal change nephropathy at the fourth weekend.Unilateral renal artery infusion was efficient to transfer Ad-Smad7 to the target kidney.Urinary protein of the Ad-Smad7 group (38.4± 6.0) decreased compared to the ADR group (69.58±10.63) at the fourth weekend (P < 0.05).Smad7 was mainly expressed in renal tubular epithelia in the Ad-Smad7 group,scarcely seen in glomeruli.The pathological changes of the Ad-Smad7 group were mild,while the changes of the Ad-GFP and ADR groups were similar to focal segmental glomerulosclerosis.Conclusions Ad-Smad7 can be transferred to the target kidney through unilateral renal artery infusion,and overexpression of Smad7 can ameliorate proteinuria and pathological changes of Adriamycin-induced nephropathy.

Keywords:recombinant adenovirus; Smad7; nephropathy; proteinuria

收稿日期：2015-10-28

文章編號：1005-8982（2016）06-0001-05

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.06.001

中圖分類號：R725.7

文獻標識碼：A