I型鈉氫交換蛋白調節細胞內酸堿平衡對胃癌細胞遷移、侵襲的影響*

謝睿，王海波，牟海軍，徐靖宇

（遵義醫學院附屬醫院消化內科，貴州遵義563099）

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I型鈉氫交換蛋白調節細胞內酸堿平衡對胃癌細胞遷移、侵襲的影響*

謝睿，王海波，牟海軍，徐靖宇

（遵義醫學院附屬醫院消化內科，貴州遵義563099）

摘要：目的觀察I型鈉氫交換蛋白（NHE1）通過調控胃癌細胞SGC-7901內酸堿值（pH）對其遷移、侵襲的影響。方法采用共聚焦顯微鏡觀察比較用特異性阻斷劑5-（N-乙基-N-異丙基）阿米洛利（EIPA）阻斷胃癌細胞SGC-7901的NHE1功能前后胞內pH值的變化，劃痕實驗觀察細胞遷移能力的改變，transwell侵襲實驗觀察細胞侵襲能力的改變。結果共聚焦實驗發現對照組細胞內pHi為（7.2±0.12），EIPA阻斷劑組（5μm）為（7.01±0.23），EIPA阻斷劑組細胞內的pH值明顯降低（P<0.05）；進一步劃痕和侵襲實驗證明加入不同濃度的EIPA（5、10和20μmol）后均能有效地抑制胃癌細胞SGC-7901的遷移和侵襲能力（P<0.05，P< 0.01），并且抑制的程度與EIPA的濃度呈劑量依賴性。結論阻斷NHE1可以降低胃癌細胞pH值，進而抑制胃癌細胞的遷移和侵襲能力。

關鍵詞：NHE1；胃癌；細胞遷移；pH；細胞侵襲

胃癌是世界上最為常見的惡性腫瘤之一，其死亡率位居癌癥死因第2位，我國屬于胃癌高發大國[1]。隨著近代醫療技術的發展，胃癌的預后雖已有改善，但5年生存率依然沒有明顯提高，究其原因與胃癌高轉移率、高復發率的特性密切相關。既往研究已證實，腫瘤酸性微環境（即外酸內堿）參與了腫瘤的生存遷移等異常細胞生物學行為的調控過程[2-3]，失調的細胞內、外酸堿值（potential of hydrogen，pH）是促使腫瘤發生、發展的一個重要誘因，因此，近年來研究者們開始重視pH調控及其相關靶分子在腫瘤領域中的重要作用。鈉氫交換蛋白家族（Na+/H-exchangers，NHE)中的I型鈉氫交換蛋白（NHE1），是存在于哺乳動物細胞上調節細胞內外正常pH值的重要膜蛋白，其通過細胞內的一個H+與細胞外的一個Na+離子進行電中性跨膜轉運達到調控PH的作用[4]，雖然已有文獻報道NHE1可能參與了乳腺癌、前列腺癌等腫瘤的發生發展[5-6]，但就NHE1與消化系統腫瘤特別是胃癌的相關性，目前主要集中在對其表達量變化（蛋白或轉錄水平）的研究，而對于通過調控NHE的蛋白活性（即功能）來揭示對胃癌細胞異常生物學行為影響的相關研究卻鮮見報道。鑒于NHE1亞型廣泛存在于多種組織細胞中，同時，本次前期研究已發現NHE1在胃癌具有蛋白表達量的變化，本實驗擬通過應用NHE1特異性阻斷劑5-（N-乙基-N-異丙基）阿米洛利[5-（N-ethyl-N-isopropyl）amiloride（EIPA）]作用于胃癌細胞后，觀察其胃癌細胞內pH（intracellular pH，pHi）的變化，以及該變化對胃癌細胞遷移、侵襲行為的影響，旨在從NHE1功能調控角度，為以NHE1為靶點治療胃癌提供依據。

1　材料與方法

1.1材料

胃癌SGC-7901細胞株購于中科院上海細胞庫，實驗用BCECF/AM、Nigericin購于Intergone公司，EIPA（美國Sigma公司），1640培養基、小牛血清、胰酶購于美國GIBCO公司，二氧化碳CO2培養箱（型號3131，美國Thermo公司），倒置相差顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡均購于德國Leica公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養SGC-7901細胞置于含有10%胎牛血清、100 u/L青霉素、100μg/L鏈霉素的RPMI 1640培養基，5%的二氧化碳CO2、37℃培養箱中培養。每2～3 d用含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液消化并傳代。

1.2.2細胞內pH測定預先將特殊的Glass Coverslip載玻片酒精浸泡并在紫外燈下照射15 min后置于6孔板內接種細胞并培養48 h，實驗時用PSS液漂洗3次后，加入終濃度為5μmol/L的BCECF/AM（pH熒光探針），室溫避光孵育30 min，孵育結束，將BCECF-AM負載好的SGC-7901細胞轉移到一個特制的灌注室中，再用PSS液漂洗10 min，激光共聚焦顯微鏡下觀察，記錄細胞內熒光值的變化，數據采集間隔時間為30 s，掃描時間為20 min。比較EIPA（5μmol）處理前后胃癌細胞SGC-7901細胞內pH值的變化。用含有尼日利亞菌素（Nigericin）的高鉀溶液催化細胞外K+和胞內H+的跨膜交換，最終使得細胞內外pH值相等，即通過高鉀溶液的pH值即換算出腫瘤細胞的pHi。

1.2.3細胞劃痕實驗取對數生長期SGC-7901細胞，常規消化細胞后計數，用無血清培養基1640稀釋細胞使其密度為2×105/ml，接種于48孔板內，每孔500μl細胞懸液，放入37℃、5%二氧化碳CO2恒溫培養箱中培養24 h，待細胞貼壁并單層平鋪長滿整個孔底部。劃痕給藥處理：取出48孔板，先用PBS清洗1次，用10μl槍頭稍微過火，呈“一”劃痕，再用PBS洗3次，徹底洗凈漂浮起來的細胞，用無血清的培養基配制不同濃度的EIPA刺激液加入孔板中，實驗分組：正常對照組（加入500μl無血清培養基）、EIPA不同濃度處理組（5、10和20μmol/L），每孔均加入總體積500μl的刺激液，繼續培養24 h，每組設3個復孔，找出給藥前拍照的原位置進行拍照，實驗結果用Image-plus軟件測量，藥物刺激前后劃痕兩側細胞間距離的變化，每張圖片測量5個距離點，細胞遷移距離=藥物刺激前兩邊細胞的距離-藥物刺激后兩邊細胞的距離。每孔取5個視野拍照，每次實驗至少重復3次。

1.2.4細胞侵襲實驗將人工基底膜（Matrigel）（40μl/孔）均勻地鋪在Transwell小室膜上，37℃放置6 h，待吸盡基質膠表面液體，下室加600μl 1640培養基，含30%胎牛血清，上室分別加入不同濃度EIPA處理液重懸的細胞懸液（細胞密度為5×105個/ml細胞）400μl/室，無血清1640培養基培養。將小室置于12空板中于37℃培養箱孵育24 h。后用1% PBS漂洗3次；用4%甲醛溶液固定30 min，蘇木精染色，梯度乙醇溶液逐級脫水，鄰苯二甲醛透明后，置于載玻片上封固。在光學顯微鏡下隨機挑選5個視野（×200）下的穿膜細胞數，計算平均細胞侵襲數量，以穿過濾膜的細胞數表示細胞的侵襲力，實驗分為正常對照組（加入600μl無血清培養基）、EIPA不同濃度處理組（5、10和20μmol/L），每次實驗至少重復3次。

1.3統計學方法

應用SPSS11.0軟件對數據進行統計學分析，數據以均數±標準差（±s）表示，用t檢驗做差異的顯著性分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1EIPA抑制NHE1功能對胞內pH的影響

首先測量靜息狀態對照組胃癌細胞SGC-7901 的pHi值，結果顯示對照組胃癌細胞pHi為（7.20± 0.12），而加入NHE1特異性抑制劑EIPA（5μmol）阻斷NHE1的功能后，pHi變為（7.01±0.23），相對于對照組pHi值顯著降低（P<0.05，見圖1）。表明胃癌細胞的NHE1具有調控細胞內pH的功能，并且通過EIPA抑制NHE1活性后會導致SGC-7901細胞內的pH值明顯降低，細胞明顯酸化，胞外微環境偏堿。

2.2EIPA抑制NHE1功能對胃癌細胞遷移能力的影響

與對照組遷移的距離（45.0±2.4）μm比較，加入不同濃度（5、10和20μmol）的阻斷劑EIPA作用24 h后能夠明顯抑制胃癌細胞SGC-7901的遷移能力[5μmol組：（38.0±4.5）μm；10μmol組：（30.0± 4.3）μm；20μmol組：（26.0±2.6）μm]，并且SGC-7901細胞遷移能力的抑制程度與EIPA的濃度呈劑量依賴性，結果見圖2、附表。

2.3EIPA抑制NHE1功能對胃癌細胞侵襲的能力影響

與對照組侵襲的細胞數量（100.75±9.42）個比較，加入不同濃度（5、10和20μmol）的阻斷劑EIPA 24 h作用后能夠明顯抑制胃癌細胞SGC-7901的侵襲能力（P <0.05）[5μmol組：（75.75±7.87）個；10μmol組：（46.5±4.35）個；20μmol組：（34.5±6.60）個]，并且SGC-7901細胞侵襲能力的抑制程度與EIPA的濃度呈劑量依賴性。結果見圖3、圖4。

圖1　對照組及EIPA組胃癌細胞的pHi曲線及統計圖

圖2　對照組及不同濃度的EIPA刺激24h后胃癌細胞的遷移距離

附表　對照組及不同濃度的EIPA刺激后胃癌細胞遷移距離統計表（n=4，μm，±s）

附表　對照組及不同濃度的EIPA刺激后胃癌細胞遷移距離統計表（n=4，μm，±s）

注：與對照組比較，1）P<0.05；2）P<0.01

分組　　對照組　5μmol組　10μmol組　20μmol組遷移距離　45.0±2.4　38.0±4.51）　30.0±4.32）　26.0±2.62）

圖3　不同濃度的EIPA刺激對胃癌細胞侵襲能力的影響

圖4　對照組及不同濃度的EIPA刺激后胃癌細胞侵襲細胞數統計圖

3　討論

多年來研究者們一直致力于胃癌發生發展的機制研究，以期為根治胃癌及改善胃癌預后尋找到新的治療途徑。但是胃癌的發生、發展是多基因、多步驟的過程，常規的化療、放療、免疫方法只能殺死原位的腫瘤細胞，卻無法完全控制腫瘤細胞的侵襲轉移過程，而腫瘤細胞的侵襲轉移往往又是腫瘤復發的根本原因，因此，針對腫瘤細胞侵襲轉移的相關機制研究刻不容緩。近年來的研究表明，腫瘤發生、轉移和侵潤均涉及復雜的細胞行為變化，而這些變化與細胞自身所處的腫瘤微環境特別是微環境的酸堿度密切相關。

既往研究發現癌細胞胞內堿性環境會促進細胞更加頻繁的新陳代謝，而外部酸性環境卻能增強腫瘤細胞遷移、侵潤轉移能力。究其原因一方面腫瘤細胞侵襲、轉移在很大程度上主要依賴于一系列蛋白酶，如金屬蛋白酶、巰基蛋白酶、絲氨酸蛋白酶及酸性蛋白酶等，他們可以去降解一系列組織屏障，在酸性環境下這些酶的活性可被增強，從而為癌細胞的侵襲創造條件[7-8]。另一方面，腫瘤細胞的遷移和侵襲主要的驅動力是板狀偽足，而板狀偽足主要是由肌動蛋白構成，它能夠突入細胞外基質，進而組裝成微絲網格，構成細胞骨架形成的驅動力。但在前述過程中，cofilin肌動蛋白和凝溶膠gelsolin蛋白的參與都是微絲組裝和解離過程中的關鍵物質，而這兩種蛋白在細胞遷移中均對pH敏感，cofilin在堿性pH中的活性高于酸性，而高濃度的質子可以激活gelsolin[9]。由此可見細胞內外的pH變化的確是調控細胞侵襲、遷移能力的重要因素，所以腫瘤酸性微環境（即外酸內堿）更有利于腫瘤細胞的侵襲、遷移。那么pH的平衡的調控機制是什么呢？進一步的研究表明胞外酸環境的形成主要依賴于胞內過量氫離子的外排行為，而NHE家族中的NHE1亞型作為胞膜上重要的氫離子交換器已被證實在細胞內外pH的調控機制中扮演重要角色。

自1989年首次克隆出人類NHE1cDNA以來[10]，到目前已知NHE基因家族中有9個亞型，它們具有相似的拓撲結構，NHE1是NHE家族中表達最為廣泛的亞型，幾乎所有的組織質膜上均有表達，被認為是一個“管家基因”。人類NHE1包含12個外顯子和11個內含子，整個cDNA全長5Kb。既往的報道證實NHE1是調控細胞外酸堿微環境的重要因子，其通過調控細胞內的一個H+與細胞外的一個Na+離子進行電中性跨膜轉運來影響細胞內外的pH平衡。在NHE1與疾病相關性的研究中，已發現NHE1抑制劑處理后的人類白血病細胞,其細胞內pH明顯降低，進而誘導腫瘤細胞發生凋亡[11]。同時，Lagana 等[12]發現用MSV轉化犬腎上皮連續細胞系，采用乙基異丙基氯毗咪處理后，細胞中NHE1的活性被明顯抑制，導致細胞內肌動蛋白應力纖維解聚合細胞骨架肌動阮重新分布，細胞偽足縮會，細胞運動被抑制。由此可見NHE1的確具有影響細胞遷移、侵襲的能力，近年來的研究還證實NHE1與前列腺癌、乳腺癌、大腸癌等腫瘤的進展、轉移均有著密切的關系[5-6]。那么，在胃癌細胞中NHE1是否也能影響細胞pH，進而影響胃癌細胞的生物學行為呢？本實驗結果發現對照組胃癌細胞SGC-7901胞內的pHi為7.20，采用NHE1特異性的阻斷劑EIPA阻斷NHE1的功能后，細胞內pH下降到7.01（P <0.05），提示NHE1在胃癌細胞的確具有調控細胞內pH的功能，阻斷了NHE1后的活性后細胞內的H+會因為無法外泵而導致胞內pH降低，形成一種外堿內酸，不利于癌細胞遷移、侵襲的微環境。本研究想證實細胞內的pH改變是否的確對胃癌細胞的遷移、侵襲能力具有影響，結果發現經NHE1阻斷劑EIPA處理，胃癌細胞SGC-7901細胞的遷移、侵襲能力較對照組（PBS）均明顯降低，這表明NHE1受體的確通過調控胃癌細胞內pHi變化影響進而腫瘤細胞的生物學行為，抑制NHE1的活性能夠明顯抑制胃癌細胞的侵襲、轉移能力。本實驗發現，至少在細胞水平，胃癌細胞NHE1很可能是胃癌發生、發展中重要的調控機制，開發一種新的NHE臨床抑制劑有可能為許多疾病的治療提供新思路和新途徑。

參考文獻：

[1] Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2013,63:11-30.

[2] Zhunussova A,Sen B,Friedman L.Tumor microenvironment promotes dicarboxylic acid carrier-mediated transport of succinate to fuel prostate cancer mitochondria[J].Am J Cancer Res,2015,5 (5):1665-1679.

[3] Justus CR,Dong L,Yang LV.Acidic tumor microenvironment and pH-sensing G protein-coupled receptors[J].Front Physiol,2013,4:354.

[4] Reshkin SJ,Cardone RA,Harguindey S.Na+-H+exchanger,pH regulation and cancer[J].Recent Pat Anticancer Drug Discov,2013,8(1):85-99.

[5] Amith SR,Fliegel L.Regulation of the Na+/H+exchanger (NHE1) in breast cancer metastasis[J].Cancer Res,2013,73(4):1259-1264.

[6] Chatterjee S,Schmidt S,Pouli S.Membrane androgen receptor sensitive Na+/H+exchanger activity in prostate cancer cells[J].FEBS Lett,2014,588(9):1571-1579.

[7] Li Y,Tang ZY,Ye SL,et al.Establishment of cell clones with different metastatic potential from the metastatic hepatocellular carcinoma cell line MHCC97[J].World J Gastroenterol,2001,7 (5):630-636.

[8] Venkataraman K,Futerman AH.Do longevity assurance genes containing Hox domains regulate cell development via ceramide synthesis[J].FEBS Lett,2002,528(1-3):3-4.

[9]安彩艷,包良,阿拉坦高勒.胞外酸性與腫瘤的浸潤轉移[J].中國生物化學與分子生物學報,2013,29(4):926-931.

[10] Spasov AA,Gurova NA,Kharitonova MV.Structure and physiological role of NHE1 and pharmacological regulation of its activity[J].Eksp Klin Farmakol,2013,76(1):43-48.

[11]常城,孔佩艷,陳幸華.NHE-1特異性抑制劑DMA逆轉HL-60/ADM細胞多藥耐藥的實驗研究[J].第三軍醫大學學報,2007,29(4):328-330.

[12] Lagana A,Vadnais J,Le PU,et al.Regulation of the formation of tumor cell pseudopodia by the Na+/H+exchanger NHE1[J].J Cell Sci,2000,113(20):3649-3662.

（張蕾編輯）

Effect of NHE1-regulated intracellular pH on invasion and migration of gastric cancer cells*

Rui Xie,Hai-bo Wang,Hai-jun Mu,Jing-yu Xu
(Department of Gastroenterology,the Affiliated Hospital,Zunyi Medical College,Zunyi,Guizhou 563099,China)

Abstract:objective To observe the effect of Na+/H+exchanger 1 (NHE1)-regulated intracellular pH on the invasion and migration of gastric cancer cell line SGC-7901.Methods The gastric cancer cell line SGC -7901 was treated with the NHE1 specific inhibitor 5-(N-ethyl-N-isopropyl) Amiloride (EIPA),the intracellular pH of SGC-7901 was measured using confocal fluorescence microscope.The migration of SGC-7901 cells was examined by scratch test.The invasion of SGC -7901 cells was examined by transwell chamber invasive test.Results The intracellular pH in the control group was (7.2±0.12),it significantly reduced to (7.01±0.23) in the 5-μmol EIPA group.EIPA of different concentrations (5 μmol,10 μmol and 20 μmol) could inhibit the invasion and migration of SGC-7901 cells in a dose-dependent manner.Conclusions NHE1 plays an important role in the regulation of intracellular pH.Blockage of NHE1 could restrain the invasion and migration of gastric cancer cells.

Keywords:NHE1; gastric cancer; cell migration; pH; cell invasion

[通信作者]徐靖宇，E-mail：xujingyu-gzzy@126.com

*基金項目：貴州省衛生計生委科學技術基金項目（No：gzwjkj2014-2-165）

收稿日期：2015-10-07

文章編號：1005-8982（2016）06-0006-05

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.06.002

中圖分類號：R975.6

文獻標志碼：A