胰島素樣生長因子結合蛋白7過表達對人乳腺癌細胞系-7增殖的影響及其機制研究

魏麗瑤，岳春燕，彭?。ㄖ心洗髮W湘雅醫院普外科，湖南長沙410008）

?

胰島素樣生長因子結合蛋白7過表達對人乳腺癌細胞系-7增殖的影響及其機制研究

魏麗瑤，岳春燕，彭健
（中南大學湘雅醫院普外科，湖南長沙410008）

摘要：目的探究過表達胰島素樣生長因子結合蛋白7（IGFBP7）對人乳腺癌細胞系-7（MCF-7）增殖的影響及其機制。方法采用LipofectamineTM2000將pIRES2-ZsGreen1-IGFBP7質?；騪IRES2-ZsGreen1空白質粒轉染進MCF-7乳腺癌細胞，并用熒光顯微鏡鑒定細胞轉染；實時熒光定量聚合酶鏈反應（Real-time PCR）對轉染48 h后IGFBP7蛋白進行定量；細胞凋亡實驗檢測轉染24、48和72 h后各組細胞增殖情況；Western bolt檢測轉染48 h后各組細胞（蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白）（AKT/mTOR）信號通路相關蛋白的表達。結果Real-time PCR的檢測結果提示經過IGFBP7轉染的細胞IGFBP7 mRNA表達水平明顯升高；細胞凋亡實驗結果發現，與空白處理組和空白質粒轉染組比較，IGFBP7過表達組細胞增殖能力明顯降低；Western bolt檢測結果發現，AKT蛋白的磷酸化水平明顯下降，且其下游的mTOR表達明顯下降（P<0.05）。結論IGFBP7過表達對MCF-7乳腺癌細胞的增殖具有抑制效果，可能是通過對AKT/mTOR信號通路的抑制達到對MCF-7的抑制。

關鍵詞：實時熒光定量聚合酶鏈反應；胰島素樣生長因子結合蛋白7；增殖；蛋白激酶B

胰島素樣生長因子結合蛋白（insulin like growth factor binding proteins，IGFBPs），是一種對哺乳動物細胞中的胰島素樣生長因子（insulin like growth factors，IGFs）的生物利用度具有調節作用的蛋白質，因此在細胞的分化、增殖和生長等代謝過程中，IGFBPs具有極為重要的作用。目前研究發現，人體內有7種IGFBPs的亞型[1]。根據其對IGF的親和力的不同將其分為低親和力的IGFBP7～10和高親和力的IGFBP1～6[2]。低親和力的IGFBPs與IGFs的親和力僅是高親和力IGFBP的1/25～1/5。在低親和力IGFBPs中最先被證實的是IGFBP7。

IGFBP7在人體中的分布較為廣泛，諸如脾臟、大小腸以及卵巢等組織器官中均有表達，但研究[3]發現若組織發生腫瘤樣變，其表達水平將發生下調甚至缺失，如在肝癌、前列腺癌以及乳腺癌等惡性腫瘤中；在正常的乳腺導管以及小葉上皮細胞中IGFBP7也有表達，在發生衰老的乳腺上皮細胞中則出現IGFBP7過表達現象[3]，乳腺癌組織中IGFBP7的表達卻明顯降低，并且與癌組織的惡性程度之間呈負相關[4]。由此可見，胰島素樣生長因子結合蛋白7能作為特異性標志物從病理學和血清學方面診斷乳腺腫瘤，同時IGFBP7有可能是一腫瘤抑制基因，可能成為腫瘤治療的新靶點。因此，本實驗通過在乳腺癌MCF-7細胞中過表達IGFBP7，研究IGFBP7的過表達對乳腺癌細胞增殖的影響。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

pIRES2-ZsGreen1-IGFBP7質粒、人乳腺癌細胞系-7（michigan cancer foundation-7，MCF-7）由本實驗室保存，胎牛血清、達爾伯克必需基本培養基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM）培養基購買于杭州四季青公司，胰酶、噻唑藍、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購買于南京凱基生物公司，質粒提取試劑盒購買于美國Omega Bio-Tek公司，LipofectamineTM2000轉染試劑購買于美國Invitrogen公司，兔抗人IGFBP7、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG購自美國Sigma公司，增強化學發光法（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色試劑盒來自南京凱基公司。

1.2儀器與設備

超凈工作臺購自蘇州基團安泰空氣技術公司，微量移液器購自德國Eppendorf公司，電熱恒溫干燥箱購自上海精宏實驗設備公司，聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀購于德國Eppendorf公司，電子天平購自于德國精密儀器廠，恒溫水浴鍋購自海爾公司，凝膠成像系統購自美國Kodak公司。

1.3質粒抽提

采用Endo-Free Plasmid Mini KitⅡ進行質粒抽提：取搖菌后菌液離心收集，加入500μl SolutionⅠ重懸，加入500μl SolutionⅡ裂解，加入250μl冰浴Buffer N3中和生成白色沉淀，取上清液加入內毒素吸附緩沖液去內毒素，加入無水乙醇，離心吸附柱離心收集，加入500μl Buffer HB除蛋白質，700μl 2次DNA Wash Buffer脫鹽，最后洗脫，酶標儀檢測。

1.4MCF-7細胞培養

用10%的胎牛血清DMEM培養基，在37℃、5%二氧化碳CO2細胞培養箱中培養MCF-7乳腺癌細胞，待細胞增殖80%～90%時，用胰酶消化傳代。

1.5細胞轉染

在24孔板中接種MCF-7細胞，5×104個/孔，于第2天使用LipofectamineTM2000將pIRES2-Zs-Green1-IGFBP7質?；騪IRES2-ZsGreen1空白質粒轉染進MCF-7乳腺癌細胞，分為空白對照組、空白質粒轉染組和IGFBP7質粒轉染組，置于37℃、5%二氧化碳CO2培養箱中培養6 h換液，繼續培養24 h后，熒光顯微鏡觀察轉染率。

1.6對IGFBP7的mRNA表達水平進行測定

使用GAPDH作為PCR檢測的內參指標，引物設計如下：IGFBP7正向引物5'-TGCCATGCATCCAATTCCCA-3'，反向引物5'-TGGAGGTTTATAGC TCGGCA-3'；GAPDH正向引物：5'-TGCACCACCAA CTGCTTAGC-3'，反向引物：5'-GGCATGGACTGTGG TCATGAG-3'。反應條件設定為：95℃預變性5 min，95℃變性30s，58℃退火30s，共42個循環，最后95℃繼續延伸10 min。

1.7細胞凋亡實驗

在96孔板中加入MCF-7細胞，過夜培養，3組細胞分別轉染24、48和72 h后，再每孔中加入噻唑藍20μl，繼續4 h培養，再加入DMSO 150μl，應用自動酶標儀在570 nm處測定各組細胞的光密度（optical density，OD）值，對各組細胞的生存活力及增殖能力進行評估。

1.8Western blot檢測蛋白表達

取40μg總蛋白于10%的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，用半干式電印跡將蛋白轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別加入相應一抗，4℃過夜，洗膜后分別加入辣根過氧化物酶標記的二抗，37℃孵育1 h，洗膜后加ECL，將膜放入X線片暗盒、壓片、顯影、定影，以GAPDH的表達作為參照，比較目的條帶的灰度值與內參條帶的灰度值。

1.9統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，用單因素ANOVA統計法對數據進行分析，組間用最小顯著性差異法進行兩兩比較，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1表達載體的細胞轉染

LipofectamineTM2000轉染試劑轉染48 h后，熒光顯微鏡觀察轉染情況，質粒轉染成功，且轉染率> 70%。見圖1。

2.2轉染后MCF-7細胞中IGFBP7mRNA的表達

轉染48 h后，RT-PCR檢測各組細胞的IGFBP7 mRNA水平，空白處理組和空白質粒轉染組比較，差異無統計學意義（P=0.121），IGFBP7組細胞與空白處理組比較，差異有統計學意義（P =0.012），且IGFBP7 mRNA水平升高。IGFBP7組細胞和空白質粒轉染組比較，差異有統計學意義（P=0.003），IGFBP7 mRNA水平升高。見圖2。

2.3MCF-7細胞的增殖能力

噻唑藍細胞活力檢測結果顯示，空白質粒轉染組與空白處理組細胞活力比較，差異無統計學意義（P=0.312），空白質粒轉染組略升高3%（見圖3）。IGFBP7組細胞活力與空白處理組比較，差異有統計學意義（P=0.005），低于空白處理組；與空白質粒轉染組比較，差異有統計學意義（P=0.001），低于空白質粒轉染組，其中72 h最為明顯（見圖4），IGFBP7可抑制MCF-7細胞增殖。

2.4IGFBP7過表達對MCF-7細胞中蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白信號通路的影響

Western blot檢測過表達轉染IGFBP7的MCF-7細胞中在蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）的蛋白表達，結果顯示3組在AKT的蛋白表達方面差異無統計學意義，但AKT蛋白磷酸化狀態，IGFBP7組減弱，同時下游的mTOR蛋白表達也減弱。見圖5。3）

圖1　質粒轉染細胞48 h熒光效果圖

圖2　轉染后48 h后各組細胞IGFBP7 mRNA的表達

圖3　各組MCF-7細胞增殖比較

圖4　24、48和72 h各組MCF-7細胞增殖情況比較

圖5　IGFBP7對MCF-7細胞中AKT/mTOR信號通路的影響

3　討論

胰島素樣生長因子結合蛋白7作為IGFBP超家族中的一員，在細胞的分化、增殖和生長等代謝過程中具有極為重要的作用。其中大量的研究證實IGFBP7的表達與多種癌癥的發生相關[5-9]，是多種腫瘤的抑癌因子。

乳腺癌是常見的惡性腫瘤之一，其病死率高居女性癌癥首位，而在我國，乳腺癌的發病率不僅逐年上升，而且日趨年輕化。雖然目前對于乳腺癌的治療取得了一定的進展，但乳腺癌的發病率的增長速度仍不容樂觀。

IGFBP7可抑制多種腫瘤細胞的增殖，但其生物分子機制不盡相同。近年來研究表明，AKT/mTOR通路在腫瘤細胞增殖、血管新生和轉移以及對放化療的拮抗起重要作用，其在乳腺癌中經常被激活，乳腺癌中這條信號通路的活化高達70%。目前的研究結果顯示，AKT/mTOR信號通路的被激活可能是導致惡性腫瘤發生的一個重要原因，其主要是對細胞的周期產生影響從而對細胞的增殖發生改變。AKT/ mTOR信號通路的活化與腫瘤細胞的發展有著密切的相關性[10]。也有研究指出AKT以及下游的mTOR，將腫瘤細胞的增殖起到抑制作用[11]。本次研究中，通過過表達IGFBP7，對AKT/mTOR信號通路進行抑制，達到抑制細胞活力和增殖的目的。

本研究中IGFBP7在MCF-7乳腺癌細胞中出現過表達，對轉染細胞株的增殖和活力水平進行檢測發現，轉染組細胞的活力和增殖能力明顯下降，同時伴隨著IGFBP7的過表達，MCF-7乳腺癌細胞中的AKT/mTOR信號通路被抑制，IGFBP7的過表達與MCF-7乳腺癌細胞之間呈現負相關。

參考文獻：

[1] Baxter RC.IG F binding proteins in cancer:mechanistic and clinical insights[J].Nat Rev Cancer,2014,14(5):329-341.

[2] Kim HS,Nagalla SR,Oh Y.Identification of a family of low-affinity insulin-like growth factor binding proteins (IGFBPs):characterization of connective tissue growth factor as a member of the IGFBP super family[J].Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(24):12981-12986.

[3] Burger AM,Leyland-Jones B,Banerjee K.Essential roles of IGFBP-3 and IGFBP-rPI in breast cancer[J].Eur J Cancer,2005,41(11):1515-1527.

[4] Ivan B,Florence L,Sengul T.Molecular profiling of inflammatory breast cancer:identifi-cation of a poor-prognosis gene expression signature[J].Clin Cancer Res,2004,10(20):6789-6795.

[5] Chen QJ,Zhou HM,Chen J,et al.Using a modified TA cloning method to crease entry clones[J].Anal Biochem,2006,359:120-125.

[6] Yen TY,Li KP,Ou SC.Construction of an infectious plasmid clone of muscovy duck parvovirus by TA cloning and creation of a partially attenuated strain[J].Avian Pathol,2015,44(2):124-128.

[7] Benatar T,Yang W,Amemiya Y,et al.IGFBP7 reduces breast tumor growth by induction of senescence and apoptosis pathway[J].Breast Cancer Res Treat,2012,133(2):563-573.

[8] Suzuki H,Igarashi S,Nojima M,et al.IGFBP7 is a p53-responsive gene specifically silenced in colorectal cancer with CpG island methlator phenotype[J].Carcinogenesis,2010,31(3):342-349.

[9] Vizioli MG,Sensi M,Miranda C,et al.IGFB7:an onco-suppressor gene in thyroid carcinogenesis[J].Oncogene,2010,29(26):3835-3844.

[10] Kim EY,Kim A,Kim SK,et al.Inhibition of mTORC1 induces loss of E-cadherin through AKT/GSK-3β signaling-mediated up-regulation of E-cadherin repressor complexes in non-small cell lung cancer cells[J].Respir Res,2014,15:26.

[11] Li X,Yang Q,Yu H,et al.LIF promotes tumorigenesis and metastasis of breast cancer through the AKT-mTOR pathway[J].Oncotarget,2014,5(3):788-801.

（申海菊編輯）

Effect of IGFBP7 overexpression on proliferation of breast cancer cell line MCF-7

Li-yao Wei,Chun-yan Yue,Jian Peng
(Xiangya Hospital,Central South University,Changsha,Hunan 410008,China)

Abstract:Objective To investigate the effect of insulin-like growth factor binding protein 7(IGFBP7) on proliferation of human breast cancer cell line MCF-7 and its mechanism.Methods Plasmid pIRES2-ZsGreen1-IGFBP7 or empty plasmid pIRES2-ZsGreen1 was transfected into MCF-7 cells using LipofectamineTM2000 and the cell transfection efficiency was examined by fluorescence microscopy.Real-time fluorescent quantitative PCR (RTFQPCR) was used to quantify the expression of IGFBP7.MTT was performed to evaluate the effect of IGFBP7 on proliferation and apoptosis of MCF-7 cells at 24,48 and 72 hours after transfection.The expression of relevant proteins of AKT/mTOR signaling pathway was analyzed by Western blot.Results The IGFBP7 mRNA level increased significantly after IGFBP7 transfection.Compared with the controls,cell proliferation noticeably decreased in the IGFBP7-transfected group.Western bolt analysis indicated that the AKT phosphorylation was down-regulated,and the mTOR level dropped markedly (P < 0.05).Conclusions Overexpression of IGFBP7 could down-regulate the proliferation of MCF-7 cells,possibly via inhibiting the AKT/mTOR signaling pathway.

Keywords:real-time quantitative polymerase chain reaction; insulin-like growth factor binding protein 7; proliferation; protein kinase B

[通信作者]彭健，E-mail：970266784@qq.com；Tel：13607441906

收稿日期：2015-12-02

文章編號：1005-8982（2016）06-0015-04

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.06.004

中圖分類號：R737.9

文獻標識碼：A