桔酒降酸細菌的篩選及特性研究

戴小芳，劉　飛，侯志華，吳　夢，陳茂彬，鎮　達（湖北工業大學發酵工程教育部重點實驗室/工業發酵湖北省協同創新中心，生物工程學院，湖北武漢430068）

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桔酒降酸細菌的篩選及特性研究

戴小芳，劉飛，侯志華，吳夢，陳茂彬，鎮達
（湖北工業大學發酵工程教育部重點實驗室/工業發酵湖北省協同創新中心，生物工程學院，湖北武漢430068）

摘要：為利用生物方法降低桔酒酸度，采用檸檬酸為碳源從各種來源分離有應用潛力的細菌菌株。通過桔酒降酸實驗從14株初篩細菌中復篩得到1株優良菌株LF7，經鑒定為植物乳桿菌Lactobacillus plantarum。在完成桔酒乙醇發酵后，加入一定量LF7菌體并控制溫度、氧氣條件、糖度、酒精度及LF7接種量，這5種因素對降酸效果均有一定影響。降酸溫度20℃、初始糖度16 g/L、酒精度5 %vol條件下發酵6 d，總酸含量可降低29.7 %。紙層析分析顯示原酒中的檸檬酸完全被利用分解。

關鍵詞：降酸細菌；桔酒；總酸；檸檬酸；果酒

不同柑橘果汁的酸度含量可達到5～16 g/L（以檸檬酸計），折合為酒石酸為5.8～18.8 g/L，遠遠超出國標GB 15037—2006《葡萄酒》中規定的滴定酸5.0～8.0 g/L（以酒石酸計）范圍[1-3]。果酒中過高的有機酸會造成酒味過酸，酒體粗糙以致難以入口。桔酒中存在的有機酸主要為檸檬酸。有關果酒中檸檬酸降解的文獻不多。趙玉平等[4]篩選到對山楂酒檸檬酸降解酵母，王立芳等[5]篩選到可同時降解蘋果酸和檸檬酸的酵母。文獻報道葡萄酒二次發酵中乳酸菌也可代謝檸檬酸，但是還沒有針對柑橘酒檸檬酸降酸乳酸菌的相關報道。本研究采用以檸檬酸為碳源的MRS改良培養基進行初篩，從初篩的菌株中復篩獲得1株疑似乳酸菌的細菌，該菌株在桔酒降酸中作用效果明顯。實驗對影響該菌降酸性能的條件及果酒有機酸成分變化進行了分析。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

材料：桔酒原酒（采用10月份湖北本地桔子經過25℃下發酵6 d獲得。酸度以檸檬酸計為8.1 g/L、糖度16.0 g/L、酒精度5 %vol、總SO240 mg/L）；14株初篩菌株（利用以檸檬酸為主要碳源的MRS培養基從自然降酸果酒、酸奶、活菌飲料、泡菜汁、香蕉提子皮以及蔬菜葉中分離純化得到）；市售白砂糖用于調整糖度。

試劑：L-蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、甲酸、正丁醇等，均為國藥集團分析純試劑。

儀器：立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安）；無菌操作臺（上海智城）；分析天平、pH計（梅特勒-托利多）；移液槍（北京華美）；恒溫培養箱（寧波萊?？萍迹?。

1.2實驗方法

1.2.1復篩

14株初篩菌菌體適量接入桔子酒原酒中密封，在20℃恒溫培養箱中后發酵7 d左右。取上層酒液，測定總酸、檸檬酸殘留量，對菌株進行簡單染色后鏡檢。

1.2.2發酵條件對降酸效果影響實驗

選取的可變因素為糖度、接種量、酒精度、溫度及容器充滿系數（氧氣條件）。使用100 mL已滅菌的試管，雙層保鮮膜密閉封口。除可變因素外都采取糖度16 g/L、酒精度5 %vol、接種量1×105cfu/mL、容器充滿系數60 %、20℃下發酵6 d。降酸處理后的桔酒經15℃放置6 d（陳釀）后過濾，進行酸度、紙層析分析及感官品評。發酵條件的設置如下：（1）糖度，在原酒殘糖基礎上補加蔗糖，將原酒糖度調整為16 g/L、26 g/L、36 g/L、46 g/L、56 g/L；(2)接種量，從LF7斜面用原酒制備成菌懸液，分別取適量至原酒中，形成0.5×105～2.5×105cfu/mL共5個梯度；（3）酒精度，在原酒的酒精度基礎上補加無水酒精，形成5 %vol～13 %vol的5個酒精度梯度；（4）發酵溫度，設置10～30℃5個溫度梯度；（5）容器充滿系數，以容器裝滿為100 %，設定20 %～100 %共5個梯度。

1.2.3分析方法

糖度：果酒的殘糖測定采用斐林試劑法；酸度：酸堿滴定法，以檸檬酸計；酒精度：酒精計法，蒸餾后測定；pH值：pH計法。

有機酸紙層析分析：展開劑為正丁醇∶甲酸∶水（80∶15∶5），標準品濃度（質量體積比）琥珀酸0.6 %、蘋果酸0.4 %、檸檬酸0.28 %、乳酸0.8 %。樣品及標準品均點樣10μL，展開2 h左右，揮干溶劑后用溴甲酚紫乙醇溶液顯色。

2　結果與分析

2.1不同條件對LF7菌株的降酸效果的影響

從多種來源分離純化細菌，將這些初篩菌株接入原酒（見材料1.1）進行降酸處理，獲得1株具有明顯效果的菌株，命名為LF7。LF7分離于自然降酸桔酒中，在MRS培養基上顯示直徑約1 mm的乳白色菌落，鏡檢為桿狀細菌，革蘭氏染色陽性，27F及1492R引物擴增16S rDNA序列，產物1.5 kb左右。擴增產物經測序，在NCBI進行Microbial Nucleotide BLAST，顯示與Lactobacillus plantarum WCFS1（NC_004567）等的16SrDNA序列一致性達到99 %，可以初步判斷屬于植物乳桿菌。LF7在MRS斜面上活化后制備菌懸液用于接種。

2.1.1酒樣糖度對降酸效果的影響

在原酒中補加蔗糖以考察含糖量對LF7菌株降酸效果的影響。由圖1可知，隨著原酒中糖量的增加，酒樣酸度也逐步提高?？赡苁窃频奶欠直籐F7菌體或者雜菌利用產酸。本實驗中的后續實驗不再添加蔗糖，原酒糖度保持16 g/L。

圖1 原酒糖度對LF7菌株降酸的影響

2.1.2 LF7接種量對降酸效果的影響

實驗中酒樣中加入的LF7菌體濃度為0.5×105～2.5× 105cfu/mL。降酸處理后檢測酒樣酸度，結果見圖2，在整體趨勢上，接種量越大，酒樣酸度越低，說明增加接種量有助于降酸效果的提高。

圖2 LF7菌株接種量對桔酒降酸的影響

2.1.3不同酒精度對LF7降酸效果的影響

酒精度實驗在原酒5 %vol酒精度的基礎上添加無水乙醇至理論酒精度為5 %vol、7 %vol、9 %vol、11 %vol、13 %vol，實驗結果見圖3。隨著酒精度的提高，降酸效果整體呈現下降趨勢，在13 %時下降明顯，說明酒精度過高，不利于LF7的降酸作用。

圖3 原酒酒精度對LF7降酸效果的影響

2.1.4不同處理溫度對LF7降酸效果的影響

考慮到過高的溫度對果酒質量的影響，實驗溫度選擇10℃、15℃、20℃、25℃、30℃。實驗結果見圖4。結果顯示，隨著溫度的上升，酸度顯著下降，說明LF7菌體活性增加，提高了降酸效果。20℃時降酸效果已經比較理想，適于果酒的降酸處理。

圖4 降酸溫度對LF7降酸效果的影響

2.1.5氧氣條件對LF7降酸效果的影響

采用容器充滿系數設定不同的氧氣條件。容器充滿系數設定為20 %～100 %。實驗結果見圖5，系數越低，酒的酸度越低，說明較好的氧氣條件有利于LF7的降酸作用。在給與更多氧氣時，降酸效果可能更好?？紤]到充分利用容器及氧氣對果酒品質的影響，在實際應用時可采用容器適當密封的方法控制氧氣的暴露程度。

圖5 氧氣條件對LF7降酸效果的影響

2.2降酸果酒樣品的紙層析分析

通過紙層析，比較果汁、原酒及降酸果酒樣品中的主要有機酸成分及其變化。降酸果酒樣品的制備條件為：原酒酒精度5 %vol，糖度16 g/L，降酸溫度20℃，降酸處理6 d?？偹釡y定結果顯示，較未加LF7的對照樣，處理樣品總酸降低約30 %。由圖6可知，標準品中，琥珀酸與乳酸Rf值相近，難以區分，其他3種標準品容易辨別。桔汁的有機酸以檸檬酸為主，含較少的琥珀酸，與文獻報道一致[6]；原酒中以檸檬酸為主，琥珀酸或乳酸含量較果汁有所下降。而所有果汁及果酒樣品中基本上未出現蘋果酸，而且在點樣起點不遠處有少量其他有機酸成分，這可能與該桔子品種有關[7]。以原酒為原料降酸后，檸檬酸已經基本消失，而琥珀酸/乳酸含量增加較明顯。因為琥珀酸很少作為發酵產物積累，推測降酸后增加的部分應該是乳酸。根據文獻報道，葡萄酒的蘋果酸乳酸發酵中，檸檬酸也會平行地得以降解，有些乳酸菌的作用會產生較多的乙酸。如果LF7菌株轉化檸檬酸為乳酸而不是以乙酸為主，這對桔酒品質是有利的。

注：前4個為標準品，后4個為果汁及果酒樣品。圖6 果酒樣品主要有機酸紙層析分析

3　結論

以檸檬酸為碳源，從食品樣品中篩選出能利用檸檬酸的細菌菌株，通過接種量、初始糖度、酒精度、氧氣和溫度等條件的實驗，顯示都對降酸效果有影響。在原酒酒精度5 %vol、糖度16 g/L、降酸溫度20℃條件下，處理6 d后酸度為5.7 g/L（以檸檬酸計），較原酒酸度下降29.7 %。紙層析分析結果顯示，該降酸過程中檸檬酸被完全降解和轉化，經感官品評降酸酒樣具有酸度適宜、果香純正、酒香協調的特點。

研究中采用了16 g/L殘糖的原酒。根據實驗結果分析，殘糖水平影響降酸效果，因此，如果進一步在更低（＜4 g/L）糖度下進行降酸處理，降酸效果可能更好。另外，pH值對降酸的影響在蘋果酸乳酸發酵中非常重要，一般認為，pH3.2～3.8時可以有效實現蘋果酸乳酸發酵。本研究中，桔酒pH值一般保持在3.5～3.6，實驗采用的原酒pH3.58。在該pH值條件下，采用LF7降酸能表現出良好的降酸效果。

參考文獻：

[1]王貴元,倪麗.荊州地區6個柑橘品種成熟期果實品質的比較[J].天津農業科學, 2014,20(1)：99-101.

[2]潘曉飚,馮春梅,莫云彬,等.高橙果酒降酸技術研究[J].釀酒科技,2006(7)：65-67.

[3]朱蓮珍,沈治平.中國主要柑桔品種的營養成分[J].營養學報, 1957,2(1)：61-69.

[4]趙玉平,杜連祥,劉麗麗,等.降解山楂汁中檸檬酸酵母菌的篩選及其降解特性研究[J].微生物學報, 2004, 44(2)：235-239.

[5]王立芳,張微,文連奎.可降解L-蘋果酸和檸檬酸菌株的篩選及鑒定[J].食品科學, 2010,31(21)：279-282.

[6]張規富,謝深喜.柑橘果實檸檬酸代謝研究進展[J].中國園藝文摘, 2012(8)：1-3.

[7]趙淼,吳延軍,蔣桂華,等.柑橘果實有機酸代謝研究進展[J].果樹學報, 2008,25(2)：225-230.

Screening of a Deacidifying Bacterial Strain for Orange Wine & Study on Its Properties

DAI Xiaofang, LIU Fei, HOU Zhihua, WU Meng, CHEN Maobin and ZHEN Da
（Key Lab of Fermentation Engineering of Ministry of Education, Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation, College of Bioengineering, Hubei University of Technology, Wuhan, Hubei 430068, China）

Abstract：In order to achieve the deacidification of orange wine by biological method, 14 bacterial strains with application potentials were preliminarily separated from various sources using citric acid as substrate in MRS medium. Then a quality strain LF7 was screened out through orange wine deacidification test and it was identified as Lactobacillus plantarum. A certain amount of LF7 was inoculated after the fermentation of orange wine and five factors including temperature, oxygen conditions, sugar content, alcohol content, and LF7 inoculating quantity would influence the acidification of orange wine. As the temperature was at 20℃, initial sugar content was 16 %, and alcohol content was 5 %vol, total acids dropped by 29.7 % after 6 d fermentation. Paper chromatography analysis showed that citric acid in wine sample was decomposed thoroughly.

Key words:deacidifying bacteria; orange wine; total acid; citric acid; fruit wine

通訊作者：鎮達（1968-），男，湖北松滋人，副教授，E-mail：davezhen2010@163.com。

作者簡介：戴小芳（1992-），女，大學本科。

收稿日期：2015-10-08；修回日期：2016-01-17

DOI：10.13746/j.njkj.2015392

中圖分類號：TS262.7；TS261.4；TS261.1

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016)04-0059-03

優先數字出版時間：2016-03-04；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160304.1339.003.html。