雙酶復合水解酒糟制備可發酵糖的工藝研究

馬文鵬，裴芳霞，任海偉，張丙云（.新疆農業職業技術學院，新疆昌吉8300；.蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730050）

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雙酶復合水解酒糟制備可發酵糖的工藝研究

馬文鵬1，裴芳霞2，任海偉2，張丙云2
（1.新疆農業職業技術學院，新疆昌吉831100；2.蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730050）

摘要：為將酒糟中纖維素和半纖維素組分轉化成可發酵糖，從酶添加量、酶解時間和固液比等角度分別研究了纖維素酶和木聚糖酶的酶解參數，并考察2種酶不同添加方式對酒糟酶解糖化得率的影響，篩選適宜的酶解條件。結果表明，與纖維素酶或半纖維素酶單一酶水解相比，2種酶復合酶解效果較好，且2種酶同時添加的酶解得率最高。2種酶復合同步酶解的最優參數為纖維素酶添加量5 %，木聚糖酶添加量4 %，酶解時間為48 h，固液比為1∶20（m/v)，該條件下的還原糖和木糖得率分別為30.75 %和23.59 %。

關鍵詞：酒糟；纖維素酶；木聚糖酶；酶解糖化；還原糖；木糖

中國是白酒生產和消費大國，白酒釀造會產生大量的廢棄酒糟，每生產1 t白酒會產生鮮酒糟2～4 t。由于鮮酒糟酸度大，水分含量較高，極易腐敗變質，若不能有效轉化利用，會造成嚴重的廠區環境污染和資源浪費[1]。目前，酒糟除了直接用作家畜飼料外，還可用于生產有機肥、蛋白飼料、食用菌、燃料棒、活性炭和食醋等[2-3]。

酒糟是一種來源廣泛的木質纖維生物質，富含纖維素、半纖維素和木質素等組分，通過酶解可以轉化成葡萄糖和木糖等可發酵糖，進而作為生產乙醇、乳酸等生化產品的微生物發酵碳源。近年來，酶法水解木質纖維生物質因其降解徹底、無環境污染、副產物少、條件溫和等優點而備受關注。歐陽嘉等[4]發現，纖維素酶Celluclast 1.5 L在酶用量10 FPIU/g、底物濃度50 g/L的條件下水解低聚木糖生產廢渣48 h后，酶解得率為74.9 %，葡萄糖得率為35.1 %。朱新娜[5]研究發現，纖維素酶在酶濃度90 FPU/g、底物濃度47.2 g/L、溫度50℃、pH4.8條件下作用棉花秸稈72 h后，還原糖產量為486.9 mg/g。余先純等[6]研究發現，在溫度51.15℃、反應時間42.08 h、纖維素酶用量28.75 U/g的優化條件下，玉米秸稈糖化得率能達到42.15 %。師靜等[7]研究表明，巨菌草在纖維素酶用量44.8 U/g、底物濃度10 g/L、pH5.0和45℃條件下酶解60 h后，酶解液中還原糖含量為95.51 mg/g。上述研究主要集中于纖維素組分的專一性降解，但由于商業化的纖維素酶主要包括外切β-1,4-葡聚糖酶、內切β-1,4-葡聚糖酶和β-1,4-葡萄糖苷酶3個組分[8]，使酶解后降解產物多以葡萄糖為主。

隨著乙醇發酵基因工程菌的構建與研究，木糖等單糖也能被基因重組酵母等代謝利用[9]，因此，為進一步將除纖維素之外的半纖維素組分糖化降解為木糖等單糖，多酶復配進行酶解糖化的方法愈發受到重視。趙超等[10]采用纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶等組成的復合酶系對預處理后的玉米芯進行酶解，糖化得率為85.0 %。Zhao等[11]研究發現，當酶添加量為10 FPU/g時，用纖維素酶和β-葡萄糖苷酶同步糖化甘蔗渣24 h，其多糖轉化率高達80 %。Zhao等[12]進一步研究發現，甘蔗渣經NaOH-過氧乙酸預處理脫除木質素后，添加15 FPU/g的纖維素酶酶解120 h，還原糖得率升至92.04 %。Tabka 等[13]以麥秸為原料，發現10 U/g纖維素酶和3 U/g木聚糖酶是酶解呈協同作用的臨界點。但是對多酶復配用于白酒糟糖化降解的報道還很少，國內僅有劉高梅[14]、陳喆[15-16]、劉躍紅[17]進行了相關研究。

本研究以白酒糟為原料，從酶添加量、酶解時間和固液比等角度，在考察纖維素酶和木聚糖酶酶解參數的基礎上，進一步研究2種酶不同添加復配方式對酒糟酶解糖化得率的影響，從而篩選得到最佳的酶解方式，為酒糟酶解糖化的轉化利用奠定理論依據。

1　材料與方法

1. 1材料與設備

白酒糟：甘肅金徽酒股份有限公司，自然風干粉碎過40目篩，蛋白質16.42 %、纖維素33.17 %、半纖維素21.86 %。

試劑與耗材：纖維素酶（濾紙酶活10萬U/g，最適溫度50℃，最適pH4.8)和木聚糖酶（濾紙酶活5萬U/g，最適溫度50℃，最適pH4.8)，購自寧夏和氏璧生物技術有限公司；3,5-二硝基水楊酸等試劑均為分析純。

儀器設備：HH-4數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；TDL-5-A離心機，上海安亭科學儀器廠；GZX-9240 MBE數顯鼓風干燥箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；Cary 50紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1理化指標的測定

蛋白質含量測定參照GB 5009.5—2010；纖維素和半纖維素含量測定參照國標GB/T 20805—2006、GB/T 20806—2006、GB/T 23881—2009；淀粉含量測定參照GB/T 5009.9—2008；還原糖的測定采用DNS法；木糖的測定采用間苯三酚比色法[18]。

1.2.2酒糟的酶解實驗方案篩選

為確定纖維素酶和木聚糖酶適宜的酶添加量、酶解時間和料液比，首先進行了單因素實驗，分別考察酶添加量（1 %、2 %、3 %、3 %、4 %、5 %和6 %，w/w)，酶解時間（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h），料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25，w/v）對酶解效果的影響。

具體方法：準確稱取5.0 g酒糟置于一定體積的pH4.8乙酸-乙酸鈉緩沖液，按照實驗設計的酶添加量分別加入一定量的纖維素酶和木聚糖酶，混勻后置于50℃振蕩培養箱中進行酶解實驗。酶解結束后，沸水浴滅酶10 min，快速冷卻后于3900 r/min下離心20 min，取上清液定容至100 mL，分別測定其還原糖和木糖濃度，計算糖得率。

在此基礎上，按照表1的酶添加順序進行雙酶組合酶解方案的篩選，酶添加量和時間等參數與單因素實驗一致，分步酶解過程中酶1水解結束、滅酶后方可再加入酶2繼續作用。組合酶解結束后測定其還原糖濃度和木糖濃度，計算糖得率。

還原糖得率（X，%）和木糖得率（Y，%）的計算公式如下：

式中：v——酶解液的體積，L；

c1、c2——酶解液中的還原糖和木糖濃度，g/L；

m——酒糟質量，g；

w1、w2——酒糟中的纖維素和半纖維素質量分數，%。

表1 酶添加順序組合方案設計

2　結果與分析

2.1單一酶酶解參數的篩選

2.1.1酶添加量對酶解效果的影響

由圖1可知，不同的纖維素酶用量對酶解效率有較大影響，當纖維素酶用量從1 %增加到5 %，酶解24 h后，酶解液中還原糖得率從16.87 %增加到21.46 %，進一步提高纖維素酶用量，酶解得率的上升幅度趨于平緩。從盡可能降低纖維素酶成本的經濟角度考慮，纖維素酶的適宜添加量為5 %。而木聚糖酶在添加量為4 %，酶解時間36 h時，木糖得率達到最大值17.46 %。這是由于在酶解初期，纖維素酶的酶切位點主要作用于無定形區，酶與無定形區的纖維分子結合產生催化酶解作用，酶解速度快。而隨著酶解反應的進行，酶難以滲入纖維分子結晶區的致密結構，造成酶解速率降低，而酶解產物也會對酶解反應產生抑制作用[19]。

圖1 酶添加量和時間對酶解得率的影響

2.1.2固液比對酶解效果的影響

由圖2可知，纖維素酶和木聚糖酶在酶解過程中，隨著固液比的減小，還原糖和木糖得率均呈逐漸上升的趨勢，且在1∶20時達到最大值，分別為23.29 %和12.37 %。當繼續增加液體比例，得率反而下降。這是由于料液比較高時，體系濃度和黏度值較高，酶解反應的傳熱傳質進程易受高黏度影響，而液體體積的增加可以降低體系黏度，增加傳質過程，同時增大了酶和底物的接觸機率，但液體過量又會對酶解作用造成“稀釋”，降低酶與底物的作用機率，故選擇1∶20為最佳固液比。

圖2 固液比對還原糖和木糖得率的影響

2.2酶添加方式對酶解得率的影響

由圖3可知，纖維素酶單獨作用對酒糟的酶解效果優于木聚糖酶，但與單一酶水解相比，雙酶分步或同步添加的組合法均能有效提高酶解得率，且同步添加纖維素酶及木聚糖酶的還原糖和木糖得率最大，分別為30.75 %和23.59 %。一方面是因為木聚糖酶優先吸附到半纖維素和細小纖維的表面，半纖維素和細小纖維被酶解溶出。同時，木聚糖酶破壞了半纖維素對纖維素酶的吸附作用，使纖維素酶的酶解效率提高[20]。另一方面，木聚糖酶具有水解半纖維素和纖維素的雙重活性，對纖維素表現出很大的親和性，可以酶解半纖維素和細小纖維生成還原糖[21]，故纖維素酶和木聚糖酶同步復合酶解效果最好。

3　結論

采用纖維素酶和木聚糖酶對酒糟進行復合酶解，通過單因素實驗和酶組合實驗研究發現，纖維素酶和木聚糖酶雙酶同步酶解效果最好，篩選后的纖維素酶和木聚糖酶添加量分別為5 %和4 %，二者同步酶解時間為48 h，固液比為1∶20（m/v)，該條件下，還原糖和木糖得率分別為30.75 %和23.59 %。

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The Preparation of Fermentable Sugar through the Hydrolysis of Distillers Grains by Two Enzymes

MAWenpeng1，PEI Fangxia2，REN Haiwei2and ZHANG Bingyun2
(1.Xinjiang Agricultural Vocational Technology College, Changji, Xinjiang 831100; 2. School of Life Science and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou,Gansu 730050, China)

Abstract:Cellulose and hemi-cellulose of distillers grains could be converted into fermentable sugar in practice. In this study, the hydrolysis parameters of cellulase and xylanase were investigated respectively from the angle of enzyme adding level, hydrolysis time, and solid-liquid ratio etc. Besides, the effects of different adding patterns of two enzymes on the yield of fermentable sugar were investigated. The results suggested that, the combined use of cellulase and xylanase was superior to single use of celluase/xylanase in the hydrolysis of distillers grains, and simultaneous addition of the two enzymes could achieve the highest yield of fermentable sugar. The best hydrolysis parameters were summed up as follows: the adding level of cellulase was 5 %, the adding level of xylanase was 4 %, hydrolysis time was 48 h, and solid-liquid ratio was 1∶20 (m/v). Under above conditions, the yield rates of reducing sugar and xylose were 30.75 % and 23.59 % respectively.

Key words:distillers grains; cellulase; xylanase; hydrolysis & saccharification; reducing sugar;xylose

通訊作者：任海偉（1983-），男，副教授，研究方向為食品科學，E-mail：rhw52571119@163.com。

作者簡介：馬文鵬（1983-），男，回族，副教授，碩士，研究方向為食品科學。

收稿日期：2015-11-16

基金項目：新疆維吾爾自治區高?？蒲杏媱濏椖壳嗄杲處熆蒲信嘤穑╔JEDU2014S086）；甘肅省自然科學基金項目（148RJZA015）。

DOI：10.13746/j.njkj.2015438

中圖分類號：TS262.3；TS261.4；TS261.9

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）04-0089-04

優先數字出版時間：2016-01-22；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160122.1015.007.html。