Eales病患者血清中T淋巴細胞因子的檢測及臨床分析△

趙娜　陸勤康　魏世輝　王惠云　童奇湖　賴曉明

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·臨床研究·

Eales病患者血清中T淋巴細胞因子的檢測及臨床分析△

趙娜陸勤康魏世輝＊王惠云童奇湖賴曉明

【摘要】目的檢測Eales病患者血清中的T淋巴細胞(T細胞)因子。方法采用Luminex技術分別檢測Eales病首發病例組、治愈病例組和健康對照組血清中輔助性T細胞1(TH1)亞群分泌的腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(IFN-γ)和Th2細胞亞群分泌的白細胞介素4(IL-4)的濃度變化。結果TNF-α在首發病例組、治愈病例組和健康對照組的濃度分別為(23.08±0.22)、(12.36±0.16)、(12.38±0.13) pg/mL；IFN-γ的濃度分別為(18.23±0.26)、(7.07±0.19)、(6.66±0.22)pg/mL。首發病例組和治愈病例組(P<0.001)，首發病例組和健康對照組(P<0.001)，治愈病例組和健康對照組(P=0.04)，各組比較差異均有統計學意義。IL-4在首發病例組、治愈病例組和健康對照組的濃度分別為(4.18±0.19)、(4.16±0.13)、(4.15±0.12)pg/mL。首發病例組和治愈病例組(P=0.03)，首發病例組和健康對照組(P=0.01)，各組比較差異均有統計學意義；治愈病例組和健康對照組(P=0.79)差異無統計學意義。Th1和Th2細胞代表因子的比值IFN-γ/ IL-4在首發病例組、治愈病例組和健康對照組分別為4.26±0.11、1.70±0.08和1.49±0.06。首發病例組與治愈病例組(P<0.001)，首發病例組與健康對照組(P<0.001)，治愈病例組與健康對照組(P=0.02)，各組比較差異均有統計學意義。結論Eales病患者血清中T細胞因子的濃度均有不同程度升高，且Th1/Th2比值升高?？梢奣h1亞群分泌的細胞因子占優勢，可以證明T細胞亞群的失衡參與了Eales病的免疫機制。(中國眼耳鼻喉科雜志，2016，16：99-102)

【關鍵詞】Eales??；免疫因子；Luminex

△基金項目：寧波市醫學科技計劃項目(2010A16)

作者單位：浙江省寧波市鄞州人民醫院眼科中心(寧波大學醫學院附屬鄞州醫院眼科中心)寧波315040；

＊中國人民解放軍總醫院眼科中心北京100853通訊作者：陸勤康(Email: 12556677@qq.com)

Eales病又稱視網膜靜脈周圍炎(idiopathic retinal vasculitis)，是一種視網膜血管炎癥性疾病，以血管的炎性滲出、玻璃體反復出血為主要特征，多為雙眼先后發病。在青年男性中患病率高，致盲率高[1]。該病的病因及發病機制尚無明確定論，多數學者認為Eales病是由多種病因、多種系統參與引起的眼部疾病[2]。近年來已陸續有報道[3]提示，自身免疫機制存在于Eales病的發病機制中；而在1型糖尿病[4]、系統性紅斑狼瘡[5]、類風濕關節炎[6]等自身免疫性疾病中，已經證實T淋巴細胞(T細胞)因子的變化參與了其免疫機制?，F為探討Eales病的免疫機制中是否也存在T細胞因子的變化，我們對Eales病患者血清中T細胞因子進行檢測并做臨床分析，為揭示Eales病的發病機制提供理論依據。

1資料與方法

1.1研究對象的選擇及分組本研究選擇Eales病首發病例33例，設為首發病例組，均為男性；發病年齡21～39歲，平均(30.04±9.23)歲。臨床有玻璃體出血23例、未出血10例。治愈病例33例，設為治愈病例組，均為男性；發病年齡20～39歲，平均(29.87±9.08)歲。臨床有玻璃體出血20例、未出血13例。同時選擇健康獻血者33例作為健康對照組，年齡為20～40歲，既往健康，無自身免疫性疾病及遺傳病等病史，全身及眼部檢查正常。無特殊病史，眼科檢查無異常。

本研究的診斷標準在Biswas等[7]提出的Eales病疑似病例診斷標準基礎上，通過眼底表現、熒光素眼底血管造影(fundus fluorescein angiography, FFA)2項檢查顯示血管旁白鞘和靜脈管壁著染均陽性者，即可診斷為視網膜靜脈周圍炎(圖1A、B)。治愈病例組患者通過口服藥物如皮質類固醇激素、激光光凝術和玻璃體-視網膜手術等方法治療，以玻璃體積血吸收或手術清除，無玻璃體視網膜增殖性改變；視網膜周邊可見靜脈白鞘或硬化但無視網膜水腫及出血；FFA無靜脈滲漏作為Eales病臨床治愈標準(圖1C、D)。

1.2方法受試者于晨起空腹抽取靜脈血,按試劑盒要求分離血漿,-30 ℃冰箱保存待測。試劑盒購自美國R&D Systems公司，采用LuminexTM100-液相芯片分析平臺(美國Luminex公司研制)同時對腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor α，TNF-α)、干擾素γ(interferon γ,IFN-γ)、白細胞介素4(interleukin 4,IL-4)進行檢測。應用MasterPlexTMQT多元數據分析軟件繪制標準曲線，直接計算出同一孔中TNF-α、IFN-γ、IL-4的含量。

圖1.眼底照相及FFA
A. Eales病患者首發病例眼底照相顯示黃斑星芒狀滲出，靜脈可見白色炎癥滲出，顳側可見血管白鞘，視網膜點片狀出血；B. Eales病患者眼底FFA顯示，顳下象限視網膜新生血管膜扇形強熒光，血管壁熒光素滲漏，周邊部毛細血管無灌注，大片出血灶遮擋背景熒光；C. Eales病患者治愈病例眼底照相顯示顳側可見視網膜激光斑，血管白鞘，無玻璃體出血、視網膜水腫及出血；D. Eales病患者治愈病例眼底FFA顯示，眼底大致正常，無視網膜水腫及出血，無靜脈壁著染及滲漏

1.3統計學處理應用SPSS18.0分析軟件One-Way ANOVA進行統計學分析，P<0.05為差異有統計學意義，所得數據以均數±標準差表示。

2結果

Eales病患者Th1型細胞因子TNF-α在首發病例組、治愈病例組和健康對照組的濃度含量分別為(23.08±0.22)、(12.36±0.16)、(12.38±0.13) pg/mL。首發病例組和治愈病例組(P<0.001)，首發病例組和健康對照組(P<0.001)，治愈病例組和健康對照組(P=0.03)，各組比較差異均有統計學意義。

IFN-γ在首發病例組、治愈病例組和健康對照組的濃度含量分別為(18.23±0.26)、(7.07±0.19)、(6.66±0.22)pg/mL。首發病例組和治愈病例組(P<0.001)，首發病例組和健康對照組(P<0.001)，治愈病例組和健康對照組(P=0.04)，各組比較差異均有統計學意義。

Th2細胞因子IL-4在首發病例組、治愈病例組和健康對照組的濃度含量分別為 (4.18±0.19)、(4.16±0.13)、(4.15±0.12)pg/mL。首發病例組和治愈病例組(P=0.03)，首發病例組和健康對照組(P=0.01)，差異均有統計學意義；治愈病例組和健康對照組(P=0.79)，差異無統計學意義。

Th1和Th2細胞因子的比值IFN-γ/ IL-4在首發病例組、治愈病例組和健康對照組的比值分別為4.26±0.11、1.70±0. 08和1.49±0.06。首發病例組與治愈病例組(P<0.001)，首發病例組與健康對照組(P<0.001)，治愈病例組與健康對照組(P=0.02)，各組差異均有統計學意義(表1)。

表1　3組Th1、Th2細胞所分泌的細胞因子情況(pg/mL)

3討論

Th細胞根據功能不同可分為Th1和Th2細胞2個亞群，兩者通過分泌的不同細胞因子間的相互制約，處于動態平衡狀態，維持著機體免疫系統的正常功能，Th1/Th2細胞平衡變化是體內炎癥反應與抗炎反應及免疫平衡變化的基礎[8]。

本實驗采用較先進的Luminex實驗技術，通過 LuminexTM100-液相芯片分析平臺，可同時對Eales病患者治療前、后血清中細胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-4進行檢測， 再應用MasterPlexTMQT多元數據分析軟件繪制標準曲線，直接計算出同一孔中IFN-γ、TNF-α、IL-4的含量。Luminex實驗技術是在流式細胞術、酶聯免疫吸附試驗和芯片的基礎上開發的新一代研究平臺，是一套多功能的液相反應檢測系統。目前國內應用少見。

實驗檢測結果顯示，Eales病患者血清中TNF-α的濃度升高。TNF-α是一種由單核-巨噬細胞和血管內皮細胞等分泌的調節機體免疫和代謝過程的多功能細胞因子，過量的TNF-α可引起炎癥損傷和免疫抑制效應[9]。TNF-α在首發病例組患者血清中的濃度升高可能是因為TNF-α作為炎癥介質，使局部發生炎癥反應及周圍組織白細胞積聚，血管通透性增加，纖維蛋白沉積，微血栓形成，并刺激中性粒細胞附著血管壁，釋放溶酶體等物質，導致局部血管內皮細胞出現損傷及脫落，形態發生顯著變化，以及大量炎性細胞浸潤，造成血管炎的發生，甚至出血[10]。另外，微血管病變是Eales病的特征性表現，TNF-α導致內皮細胞的損傷可能是引起微血管病變的主要因素。

另外，Eales病患者血清中IFN-γ濃度升高。IFN-γ為Ⅱ型干擾素，主要由活化的T細胞和自然殺傷細胞分泌，是典型的 Th1型炎性細胞因子，具有多種抗腫瘤和免疫調節作用，包括激活巨噬細胞和增強T細胞介導的細胞免疫[11]。Eales病患者首發病例組的血清中IFN-γ濃度明顯升高，原因可能是IFN-γ可以顯著上調人類主要組織相容性復合體(MHC)-II在單核巨噬細胞的表達，促進自身抗原的呈遞，增強T細胞對自身抗原的反應[12]。此外， IFN-γ還可以促進細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1, ICAM-1)的表達。ICAM-1是內皮損傷的一個重要指標[13-15]。IFN-γ還具有明顯的溶細胞效應，其導致內皮細胞損傷可能是發生微血管病變的主要因素。

Th2細胞因子IL-4在首發病例組、治愈病例組和健康對照組的濃度含量分別為 (4.18±0.19)、(4.16±0.13)、(4.15±0.12)pg/mL。首發病例組和治愈病例組(P=0.03)，首發病例組和健康對照組(P=0.01)，差異均有統計學意義(P<0.05)。治愈病例組和健康對照組(P=0.79)，差異無統計學意義(P>0.05)。IL-4是B細胞增生和分化的重要因子，可減弱單核細胞的吞噬作用，抑制炎性因子IFN-γ、TNF和IL-6 的分泌，因而可控制炎癥的進展，抑制細胞免疫的作用，與IFN-γ的作用相反。IL-4控制了由Th1致炎細胞因子造成的組織損傷。有報道[16]對IL-4抑制免疫應答機制作了闡釋，IL-4作用于樹突細胞(dendritic cell, DC)的基部而減弱溶細胞性T細胞的應答。IL-4阻止抗原刺激白細胞毒性前體物質促DC分化的過程，從而影響DC 對CD8+T 細胞的活化。本實驗結果表明，患者血液中IL-4的濃度比對照組升高，可見由于Th1中的炎性因子IFN-γ和TNF-α濃度顯著升高，刺激Th2細胞中的抗炎性、抑制免疫應答因子IL-4濃度升高，以達到控制炎癥和調節免疫的目的。IL-4在Eales病的發生中起著保護免疫反應的作用[17]。

正常情況下，Th1和Th2細胞亞群兩者以相互拮抗和自身促進的方式，形成復雜有序的細胞因子網絡，分別行使各自不同的生理功能，調節正常的免疫應答。但是在某些疾病狀態下，淋巴細胞平衡失調，產生細胞因子種類和數量發生變化，導致細胞免疫及體液免疫功能紊亂，引起異常免疫應答。由于Th1/ Th2細胞比值較Th1細胞或Th2細胞更能體現患者體內Th1細胞與Th2細胞的平衡情況，多數研究以高表達IFN-γ和IL-4分別代表Th1細胞和Th2細胞進行比值分析間接反映機體免疫調節功能的情況[18]。本研究發現，Eales病患者血清中T細胞亞群存在明顯失衡，Th1細胞占優勢，分泌模式朝Th1細胞偏移, 產生了所謂“免疫漂移”現象。Th1炎癥性細胞因子增加，而抑制細胞免疫的Th2細胞因子雖然也有小幅度提高，但并沒有起到控制炎癥和調節免疫的保護作用，使血液中Th1細胞因子相對增多明顯，結果進一步導致Eales病細胞免疫及體液免疫功能紊亂，引起異常免疫應答。因此Th1/Th2細胞失衡在Eales病變中起著一定的作用。Th1/Th2細胞比例失衡通過細胞間的接觸，極大地促進了巨噬細胞和DC的活性和細胞因子的分泌，使得炎癥反應持續存在，導致Eales病的發生。在研究中，我們還發現，治愈病例組和健康對照組間也存在小幅度的Th1/Th2細胞比例失衡，說明雖然Eales病患者的眼部并發癥得到完全治愈，但是體內的T淋巴細胞亞群仍存在失衡。這可能也是Eales病容易復發的潛在因素。

通過以上的實驗研究分析，我們認為Eales病患者血清中存在因T細胞亞群失衡引起的免疫功能紊亂現象。本研究為更深入探討Eales病的免疫機制提供了理論依據，為Eales病的預防、監測和治療提供了新思路，具有一定的臨床實用價值。然而本研究只分析了患病組、治愈組、健康對照組間T細胞因子的變化，而治療效果是否會對T細胞因子產生影響尚不明確。今后將采用免疫熒光法和酶聯免疫吸附試驗進行驗證，進一步探討T細胞因子在Eales病治療指導中的作用。

參 考 文 獻

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(本文編輯諸靜英)

Detection of serum T lymphocytes cytokines of patients with Eales disease and its clinical significance

ZHAONa,LUQin-kang,WEIShi-hui＊,WANGHui-yun,TONGQi-hu,LAIXiao-ming.

OphthalmologyCenter,YinzhouPeople’sHospitalofNingboCity,YinzhouHospitalAffiliatedtoMedicalSchoolofNingboUniversity,Ningbo315040,China

【Abstract】ObjectiveTo detect the serum T lymphocytes cytokine of patients with Eales disease. MethodsLuminex technique was used to detect the concentration changes of tumour necrosis factor α(TNF-α) and interferon γ (IFN-γ) secreted by helper T cells 1 (Th1) subset and interleukin 4 (IL-4) secreted by Th2 subset in the serum of patients with Eales disease untreated group, cured group and healthy control group.ResultsThe concentrations of TNF-α in untreated group, cured group and healthy control group were (23.08±0.22),(12.36±0.16), (12.38±0.13) pg/mL, respectively; the concentrations of IFN-γ in untreated group, cured group and healthy control group were (18.23±0.26), (7.07±0. 19), (6.66±0.22) pg/mL, respectively. The differences of the concentration of TNF-α and IFN-γ between untreated group and cured group (P<0.001), untreated group and healthy control group (P<0.001), cured group and healthy control group (P=0.04), were statistically significant. The concentrations of IL-4 in untreated group, cured group and healthy control group were (4.18±0.19), (4.16±0.13), (4.15±0.12), respectively. The differences of the concentration of IL-4 between untreated group and cured group (P=0.03), untreated group and healthy control group (P=0.01) were statistically significant. While the difference was not statistically significant between cured group and healthy control group (P=0.79). The ratios of representative factors (IFN-γ/ IL-4) of Th1 and Th2 in untreated group, cured group and healthy control group were 4.26±0.11, 1.70±0. 08 and 1.49±0.06, respectively. The differences of the ratio between untreated group and cured group (P<0.001), untreated group and healthy control group (P<0.001), cured group and healthy control group (P=0.02) were statistically significant. ConclusionsConcentrations of T lymphocytes cytokines in the serum of Eales disease of patients are increased at diferent degrees, and the Th1/Th2 ratio is also increased, which indicates the domination of cytokines secreted by Th1 subset. The imbalance of T lymphocyte subsets participates in the immunological mechanism of Eales disease.(Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2016,16:99-102)

【Key words】Eales disease; Immune factors; Luminex

(收稿日期2015-04-29)

Corresponding author：LU Qin-kang, Email: 12556677@qq.com

DOI:10.14166/j.issn.1671-2420.2016.02.009