GPV感染擾動雛鵝系統互作網絡的研究

朱新產,王倩文,朱峰偉,楊麗金

(1.青島農業大學 生命科學學院,山東省高校植物生物技術重點實驗室,山東 青島　266109;2.青島即墨畜牧獸醫局,山東 即墨　266200)

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GPV感染擾動雛鵝系統互作網絡的研究

朱新產1,王倩文1,朱峰偉2,楊麗金1

(1.青島農業大學 生命科學學院,山東省高校植物生物技術重點實驗室,山東 青島266109;2.青島即墨畜牧獸醫局,山東 即墨266200)

摘要：為了解GPV(Goose parvovirus)侵染的病理學致病機理,探究GPV感染擾動雛鵝動態代謝網絡平衡系統,對GPV感染雛鵝血液中的蛋白質、代謝酶活性及其同工酶結構和功能等進行生化分析。結果顯示,GPV感染雛鵝的血液中,蛋白酶、Est、POD、SOD、ALP、ADH、Amy、CAT、GPT、LDH活性分別提高約41%/63%,30%/53%,50%/14%,36%/73%,156%/142%,1005%/22%,36%/26%,13%/51%,60%/244%,289%/139%;IgG、IgM含量分別降低約50%,40%;蛋白質含量增長約50%,GPV感染雛鵝的血漿Est、SOD、ADH、Amy同工酶分別新增2,2,1,3條酶譜帶,Est同工酶消減2條慢區譜帶;血細胞Est、POD、SOD、Amy同工酶分別新增1,2,1,2條酶譜帶;血液中CAT、LDH、GPT、ALP同工酶分別出現7,1,3,3條酶帶變異,血細胞CAT、ADH同工酶分別缺少快區和慢、快區酶帶,ALP同工酶在血漿與血細胞方面分別缺少慢區和快區酶帶。同時顯示重鏈59 kDa蛋白帶是CK組IgM/G的共同特征,感染組IgG還缺失258,36 kDa蛋白帶;血漿與血細胞分別新增加131,86,43,33 kDa和144,104,58,53 kDa蛋白。血漿消減1條慢區酶蛋白,血細胞增加2條慢區酶蛋白。提示GPV感染應激與寄主蛋白質、蛋白酶及同工酶基因表達的協同作用,通過獨特的擾動宿主動態平衡代謝網絡直接或間接調控細胞易感性能。

關鍵詞：雛鵝;鵝細小病毒;蛋白/酶;同工酶;代謝網絡

小鵝瘟(Derzsy′s病)是由鵝細小病毒(Gooseparvovirus,GPV)引起的一種高度接觸性、敗血性傳染病,感染致病具有選擇性,主要侵害雛鵝和雛番鴨,病程短,致病性強,病死率高,其流行形式隨環境發生新的轉變,呈現無規律的散發性流行[1]。雖然宿主在進化中逐步演化、形成了高效的天然免疫系統和獲得性免疫系統,分別識別病原體模式分子和抗原分子,二者相互協同,依靠動態平衡調控來抵御病原體干擾,從而實現自我防御功能[2-3]。然而由于病毒基因組大小的限制,病毒已形成了利用宿主細胞機制的能力來推動自身生命周期的有效途徑,建立了針對宿主免疫反應的逃逸機制以拮抗宿主的免疫攻擊,從而逃避免疫清除,導致病毒性的傳染病[4-5]。因此,病毒的免疫調節可能會通過常規或獨特的擾動宿主分子防御網絡來調控細胞先天免疫反應?；蚪M測序已確定了諸多與病毒易感性相關聯的胚系突變及大量的體細胞基因組變異,但從這些引起或驅動突變的數據集仍然難以區分突變的背景或致病突變[6]。故此研究GPV感染雛鵝的蛋白質、酶與同工酶的變異性,試圖探究GPV病毒在侵染過程中與宿主細胞的相互作用,了解病毒入侵細胞擾動代謝網絡由穩定的平衡狀態到紊亂狀態的轉換,旨為研究病毒侵入機制和有效預防和控制病毒傳播與感染提供科學的理論依據。

1材料和方法

1.1試驗動物

隨機挑選生長一致、健康的3日齡雛鵝60只(萊陽五龍鵝實驗基地提供)。處理組(RD):將種毒GPV YZ(由揚州大學王永坤老師提供)用無菌生理鹽水(內含青、鏈霉素各1 000 U/mL)適當稀釋,經口腔接種6日齡的雛鵝,每只接種0.2 mL;對照組(CK)接種等量的生理鹽水,連續觀察發病癥狀,分別采集血液,肝素抗凝。

1.2試驗方法

1.2.1血漿與血細胞的分離將血樣在0～4 ℃,3 000 r/min離心15 min,分別收集上部血漿和下部血細胞。

1.2.2酶/蛋白液的制備取血漿或血細胞0.5 mL,在4 ℃下,用0.5 mol/L PBS (pH值6.8)提取,10 000 r/min離心10 min,收集上清液。

1.2.3蛋白酶和淀粉酶(Amy)活性測定參照文獻[7]的方法,分別以酪氨酸和葡萄糖建立標準曲線,蛋白酶用福林酚法,680 nm波長測定光吸收值;淀粉酶用3,5-二硝基水楊酸(DNS)顯色,540 nm波長測定光吸收值,按公式:U=A·K·D/10 計算酶活力,U(μg/(mL·min)),A表示吸光值,K為換算系數,D是稀釋倍數。

1.2.4乳酸脫氫酶(LDH)和乙醇脫氫酶(ADH)活力測定參照文獻[8]的方法,采用丙酮酸鈉/乙醇-輔酶Ⅰ法,取80 μL各組織制備酶液,NADH顯色,測定340 nm波長吸光度值。以每分鐘內吸光度值變化0.001為1個LDH或ADH酶活性單位(U)。計算公式:酶活性單位(U)= ΔA340×Vt/W×Vs×0.001×t,式中,ΔA340為ΔA酶樣/min-ΔA空白/min;Vt為酶液總體積;Vs為酶液用量;t為反應時間;W為樣品重量。

1.2.5過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活力的測定參照文獻[9]的方法,分別用愈創木酚法和乙醇-鉬酸銨法,取50 μL各組織制備酶液,愈創木酚和鉬酸銨顯色,在470或405 nm波長測定吸光度值。以每分鐘內吸光度值變化 0.01為1個POD或CAT酶活性單位(U)。計算公式:酶活性(U)=ΔA470×Vt/W×Vs×0.01×t,式中,ΔA470(ΔA405)為ΔA酶樣-ΔA空白;Vt為酶液總體積(mL),Vs為酶液用量(mL),t為反應時間(min),W為樣品重量(g)。

1.2.8堿性磷酸酶(ALP)活力測定參照文獻[12]的方法,用磷酸苯二鈉法,在510 nm測吸光度值。每100 mL血清在 37 ℃與底物作用 15 min,產生1 mg 酚為1 個金氏單位(Kinggs)。按公式:ALP活力(金氏單位)=(A測定-A對照)×0.05×100/(A標準-A空白)計算。式中:A為吸光度,0.05為酚標準液(0.05 mg/mL),100為所加酶液體積 (mL)。

1.2.9谷丙轉氨酶 (GPT) 活性的測定參照文獻[13]的方法,以丙酮酸鈉-谷氨酸為反應液,2,4-二硝基苯肼顯色,520 nm波長測定光吸收值。按公式:轉氨酶活性(U)=4×ΔA520×酶液總體積/樣品總體積,式中:ΔA520= (A測定-A對照)/(A標準-A空白),4為丙氨酸轉氨酶換算單位。1.2.10蛋白質含量檢測參照文獻[14]的方法,用牛血漿蛋白為標準,紫外法檢測,蛋白質(mg/mL)=1.55×A280-0.76×A260,F1=1.115,F2=0.76。1.2.11同工酶PAGE參照文獻[15]的方法,分離膠7.0%,濃縮膠2.5%,4 ℃恒流20 mA,電泳6～7 h。蛋白酶用0.12%考馬斯亮藍R250 (CBB) 染色顯帶;EST 同工酶采用α/β醋酸-偶聯劑固蘭RR系統染色;POD同工酶和SOD同工酶分別選用聯苯胺-Vc-H2O2乙酸緩沖液系統及NBT-核黃素磷酸鹽緩沖系統(負染法)染色;ALP 同工酶采用α-萘酚磷酸鈉-固蘭RR硼酸緩沖液染色系統;LDH同工酶采用輔酶Ⅰ-NBT-乳酸鈉-Tris-HCl系統染色;ADH同工酶采用輔酶Ⅰ-NBT-乙醇-Tris-HCl系統染色;GPT同工酶用L-天冬氨酸、α-酮戊二酸Tris-HCl 緩沖系統,吡哆醛-5-磷酸-固藍BB顯色條帶;Amy同工酶用淀粉-乙酸緩沖體系預孵,碘顯色,冰乙酸/甲醇液固定;CAT同工酶用KMnO4-H2O2中性染色系統(負染法)染色;用無離子水漂洗脫色至背景清晰,pH值4.7乙酸緩沖液固定保存,透射光下照相記錄。

1.2.12血液蛋白SDS-PAGE參照文獻[16]的方法,分離膠10.0%,濃縮膠2.5%,恒流25 mA,電泳6～7 h,標準蛋白:BM523(M1)、MBI SM0431(M2)。0.12%考馬斯亮藍染色,透射光成像記錄。

1.2.13數據分析用BandScan 5.0掃描PAGE凝膠,標記分析。

2結果與分析

2.1血液中蛋白質含量與酶活性的變化

由圖1可知,受GPV感染雛鵝的血液,與對照組相比,血漿中RD組的蛋白酶、Est、POD、SOD、ALP、ADH、Amy、CAT、GPT、LDH活性分別增高0.41,0.30,0.50,0.36,1.56,10.05,0.36,0.13,0.64,2.89倍,血細胞中分別增高0.63,0.53,0.14,0.73,1.42,0.22,0.26,0.51,2.44,1.39倍;并且血細胞的POD與GPT活性分別是血漿的202～265,8～17倍,表明POD和GPT主要存在于血細胞內。血漿與血細胞的蛋白質含量也分別升高0.51,0.49倍增長約50%;而免疫球蛋白IgG、IgM含量在血漿與血細胞中分別降低了0.541,0.567和0.475,0.247倍，降低約50%和40%。

指標的系數:Est/LDH/ADH×103;POD(1)×105、(2)×104;ALP/Protein×10;SOD/CAT×102;Amy×10-1;GPT×10-2;

2.2血液中蛋白質結構組成的變化

2.2.1血液中的酶蛋白由圖2顯示,雛鵝的血液出現了5～9條不同酶蛋白譜帶,與對照組相比,受GPV感染雛鵝的血漿中減少1條慢區酶蛋白帶,而血細胞增加了2條慢區酶蛋白帶,并且酶蛋白帶灰度值變化與蛋白酶活性變化相一致。

2.2.2血液中的蛋白質由圖3可看出,雛鵝的血液出現了12～18條差別蛋白質譜帶,與對照組相比較,GPV感染雛鵝的血漿中新增加131,86,43,33 kDa蛋白條帶,血細胞中新增加144,104,58,53 kDa蛋白條帶。并且血漿及血細胞蛋白帶灰度值變化與其含量變化相一致。

M.遷移距離;G.灰度值;S.信號；CK1.血漿對照組;CK2.血細胞對照組;RD1.血漿GPV感染組;RD2.血細胞GPV感染組。圖3-13同。

M1.標準蛋白BM523；M2.標準蛋白MBI SM0431；W.分子質量(kDa)。

2.2.3血清中的免疫球蛋白由圖4顯示,雛鵝血清IgG的特征蛋白帶是58～70 kDa,CK組IgM/G的共同特征蛋白帶為59 kDa。CKIgM與RDIgM相比較,大于116 kDa的為6∶4,116～40 kDa的為4∶3,小于45 kDa的為3∶5,RDIgM明顯缺失59 kDa特征蛋白帶,低分子量蛋白明顯占優勢,而CKIgM的高分子量蛋白居多。CKIgG與RDIgG相比較,大于116 kDa的為5∶3,116～45 kDa的為5∶5,小于40 kDa的為6∶5,RDIgG明顯缺失258,36,59 kDa蛋白帶。

M.標準蛋白BM523;CKIgM.對照組IgM;CKIgG.對照組IgG;RDIgM.感染IgM;RDIgG.感染組IgG。

2.3保護酶同工酶的變化

2.3.1酯酶(Est)同工酶由圖5顯示,雛鵝血液的Est同工酶出現4條差異明顯變化譜帶,與對照組相比,GPV感染鵝的血漿減少了2條慢區譜帶,增加了2條快區譜帶。而血細胞新出現1條快區同工酶帶,并且Est同工酶譜帶灰度值變化與Est的活性變化相一致。

圖5　GPV感染雛鵝血液的Est同工酶譜與掃描參數分析

2.3.2過氧化物酶(POD)同工酶由圖6可知,GPV感染雛鵝的血細胞POD同工酶出現5條酶帶(中區),與對照組比較,新出現2條酶帶,而血漿的POD同工酶未顯出酶帶。血細胞POD同工酶譜帶灰度值變化與POD活性的變化相一致。

圖6　GPV感染雛鵝血液的POD同工酶譜與掃描參數分析

2.3.3超氧化物歧化酶(SOD)同工酶由圖7顯示,GPV感染雛鵝血液中的SOD同工酶存在慢、中、快區酶帶變異,與對照組比較,GPV感染的血漿與血細胞的SOD同工酶分別增加2，1條中區酶譜帶,并且SOD同工酶帶灰度值變化與SOD的活性變化相一致。2.3.4過氧化氫酶(CAT)同工酶由圖8可知,GPV感染雛鵝血漿中的CAT同工酶存在慢、中、快區7條酶帶變異,而血細胞中出現慢、中區3條酶帶,缺少快區酶帶。與對照組比較,RD組的血漿與血細胞的CAT同工酶譜帶灰度值與其酶活性變化相一致。

圖7　GPV感染雛鵝血液的SOD同工酶譜與掃描參數分析

2.4脫氫酶同工酶的變化

2.4.1乳酸脫氫酶(LDH)同工酶由圖9可看出,GPV感染雛鵝血液中的LDH同工酶出現1個慢區同工酶譜帶,與對照組相比,RD組的血漿與血細胞的LDH同工酶譜帶灰度值與其酶活性變化相一致。

圖9　GPV感染雛鵝血液的LDH同工酶譜與掃描參數分析

2.4.2乙醇脫氫酶(ADH) 同工酶由圖10顯示,GPV感染雛鵝血液中的ADH同工酶存在慢、中、快區酶帶變異,與對照相比,GPV感染的血漿ADH同工酶增加1條快區酶譜帶,血細胞缺少慢、快區酶帶。并且ADH同工酶帶灰度值變化與其活性的變化相一致。

圖10　GPV感染雛鵝血液的ADH同工酶譜與掃描參數分析

圖11　GPV感染雛鵝血液的Amy同工酶譜與掃描參數分析

2.5代謝酶同工酶的變化

2.5.1淀粉酶(Amy)同工酶由圖11可知,GPV感染雛鵝血液中出現了3～7個淀粉酶同工酶譜帶變化,與對照組相比,GPV感染的血漿與血細胞Amy同工酶分別增加了3,2條中區同工酶帶,并且Amy同工酶譜帶灰度值變化與Est的活性變化趨勢相一致。

2.5.2谷丙轉氨酶(GPT)同工酶由圖12顯示,GPV感染雛鵝的血細胞GPT同工酶出現3條中區酶帶,而血漿的GPT同工酶未顯出酶帶,并且血細胞GPT同工酶譜帶灰度值變化與其活性的變化相一致。

圖12　GPV感染雛鵝血液的GPT同工酶譜與掃描參數分析

2.5.3堿性磷酸酶(ALP)同工酶由圖13可看出,GPV感染雛鵝的血漿與血細胞ALP同工酶存在2,3條酶帶變異,分別缺少慢區和快區酶帶。ALP同工酶帶灰度值變化與其活性的變化相一致。

圖13　GPV感染雛鵝血液的ALP同工酶譜與掃描參數分析

2.6GPV感染對動態代謝平衡網絡的調控

受GPV感染雛鵝的血液中,蛋白質含量增長,IgG、IgM含量降低,蛋白酶、Est、POD、SOD、ALP、ADH、Amy、CAT、GPT、LDH活性分別不同程度的增高,及其他同工酶譜帶的消長差異變化。反映蛋白、酶與同工酶基因表達譜型出現變異體,直接參與了體內代謝網絡,GPV感染擾動代謝網絡平衡,宿主通過酶蛋白/酶與GPV相互作用調節多種代謝活動,應激理化病狀如圖14所示。

3討論

GPV的侵入感染是利用宿主細胞機制的能力來推動自身生命周期,易感性的蛋白/酶是必需的,每一種都會綁定到人類細胞表面的一種特殊受體,并刺激宿主細胞接受病原體。通常情況下,這些受體分子能夠執行不同的功能,如調控細胞生長和修復創傷等[17]。酶蛋白/酶多肽締合分子間互相作用的類型和頻率及構型、大小、數目,隨細胞的應激環境及功能狀態發生特異性變化,密切關聯著個體發育的病理理化特征和基因調控機制[18]。因此,GPV病毒在侵染過程中與宿主細胞協同作用,通過常規或獨特的擾動宿主分子防御網絡,由穩定的代謝平衡狀態轉換為紊亂狀態,從而調控細胞先天免疫反應。本試驗結果顯示,在受GPV感染雛鵝的血液中,IgG、IgM含量分別降低約50%和40%;蛋白質含量增長約50%,蛋白酶、Est、POD、SOD、ALP、ADH、Amy、CAT、GPT、LDH酶活性分別提高約41%/63%，30%/53%，50%/14%，36%/73%，156%/142%，1005%/22%，36%/26%，13%/51%，60%/244%，289%/139%,蛋白酶和其他酶的同工酶譜帶灰度值也呈現類似的增強趨勢。Ig具有抗體活性,調節免疫系統[19],蛋白酶調節基質動態平衡,SOD、POD和CAT是演化過程中建立的關鍵生物防御系統酶,形成解毒系統[20]。Est維持免疫耐受[21],Amy參與生理活動的能量供給和抵御病毒的侵害作用[22];LDH、ADH調節機體的NAD+/NADH的比率與生理機能，GPT調節各種生理活動,增強抗逆性,ALP直接參與磷代謝,與DNA、RNA和蛋白質脂質代謝關聯,輔助標記組織損傷程度病理狀態。提示GPV感染擾動代謝網絡平衡,宿主通過酶蛋白/酶的特征變化與GPV相互作用調節多種代謝活動,協調體內代謝平衡網絡。

圖14　GPV感染擾動動態代謝平衡調控網絡

同工酶的變異型等位基因頻率及基因型,隨應激環境和遺傳基礎的不同導致其結構或活性差異變化,反映基因表達差異或特殊功能[23]。本試驗結果表明,GPV感染雛鵝的血漿Est、SOD、ADH、Amy同工酶分別新增2，2，1，3條酶譜帶,Est同工酶消減2條慢區譜帶,POD/GPT同工酶未顯出酶帶;血細胞Est、POD、SOD、Amy同工酶分別新增1，2，1，2條酶譜帶;血液中CAT、LDH、GPT、ALP同工酶分別出現7，1，3，3條酶帶變異,血細胞CAT、ADH同工酶分別缺少快區和慢、快區酶帶,ALP同工酶在血漿與血細胞分別缺少慢區和快區酶帶。提示GPV感染應激同工酶基因與寄主的互作,誘發同工酶基因表達譜型出現變異體,出現顯性等位新基因,直接或間接調控酶促反應防御體系,是雛鵝應激GPV感染的敏感酶。

Ig不同組分間共同協作,強化功能,應答多種變化,抵御外源病原微生物的侵襲,而對機體無任何副作用[24]。本試驗研究顯示,鵝血清IgG的特征蛋白帶是重鏈(58～70 kDa),重鏈59 kDa蛋白帶是CK組IgM/G的共同特征,而RD組明顯缺失這個特征蛋白帶,RDIgG還缺失258,36 kDa蛋白帶。提示GPV的感染影響了雛鵝血清Ig基因的表達,使雛鵝血清IgM/G基因表達的蛋白圖譜發生了改變,59 kDa重鏈Ig是GPV的敏感蛋白,Ig基因是鵝細小病毒的易感基因。同時GPV感染雛鵝的血漿消減了1條慢區酶蛋白,新增加131,86,43,33 kDa蛋白。而血細胞增加2條慢區酶蛋白和144,104,58,53 kDa蛋白。提示GPV感染應激基因表達的變異,改變酶/蛋白構成的亞基結構,直接或間接地調控代謝途徑與生理機能,因此，蛋白質、酶及同工酶發生變異的基礎是GPV感染與宿主基因表達的協同互作,通過擾動平衡代謝網絡直接或間接調節病理性能,是雛鵝應激病癥的有效標記。

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Study on Perturbing Systematic Interaction Network of GPV-gosling in an Infectious Context

ZHU Xinchan1,WANG Qianwen1,ZHU Fengwei2,YANG Lijin1

(1.College of Life Science,Qingdao Agricultural University,Key Laboratory of Plant Biotechnology in University of Shandong Province,Qingdao266109,China;2.Jimo Bureau of Animal Husbandry and Veterinary,Jimo266200,China)

Abstract：Perturbing systematic host network for Goose parvovirus (GPV) in natural infection were still unknown.Understanding pathogenic mechanism required that protein,enzymes and isozyme from goslings infected as manifestations of network properties,rather than simply as the result of individual variations.Here blood of experimentally GPV infected goslings were examined by biochemical analysis.The results indicated that the activity of protease,Est,POD,SOD,ALP,ADH,Amy,CAT,GPT and LDH from goslings infected GPV were higher 41%/63%,30%/53%,50%/14%,36%/73%,156%/142%,1005%/22%,36%/26%,13%/51%,60%/244%,289%/139% than that of control group respectively.The content of IgG and IgM from goslings infected GPV were lower 50%,40% than that of control group respectively,but protein was higher 50%.The isozyme of Est,SOD,ADH and Amy appeared 2,2,1,3 new enzyme band respectively,but deleted 2 slow-zone Est isozyme band in the serum of goslings infected Goose parvovirus.The isozyme of Est,POD,SOD and Amy appeared 1,2,1,2 new enzyme band in the blood corpuscle of goslings infected Goose parvovirus respectively.The isozyme of CAT,LDH,GPT and ALP appeared 7,1,3,3 variation band in the blood of goslings infected GPV respectively.The isozyme of CAT and ADH defected fast-zone and slow-zone,fast-zone band in the blood corpuscle of goslings infected Goose parvovirus respectively.The isozyme of ALP defected slow-zone and fast-zone band in the serum and blood corpuscle of goslings infected GPV respectively.At the same time,it also showed that the 59 kDa protein band was a common feature of IgM/G in gosling,and IgG deleted still 258,36 kDa protein in the blood of goslings infected Goose parvovirus.The protein were increased by 131,86,43,33 kDa and 144,104,58,53 kDa band in the serum and blood corpuscle of goslings infected Goose parvovirus respectively.There were deleted 1 slow-zone zymoprotein band in the serum of goslings infected GPV,and increased 2 slow-zone zymoprotein band in the blood corpuscle of goslings infected GPV.Those suggested that the interaction of GPV stress and host protein/enzymes and isozyme gene expression,through unique host dynamic balance of metabolic network directly or indirectly regulated cell disturbance susceptible performance.

Key words:Gosling;Goose parvovirus;Protein/Enzymes;Isozyme;Metabolic network

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.032

中圖分類號：S852.3

文獻標識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)02-0195-10

作者簡介：朱新產(1959-),男,陜西武功人,教授,博士,主要從事病毒感染致病機制研究。

基金項目：山東省自然科學基金項目(ZR2011CM008);青島市科技發展計劃項目(12-1-4-5-(2)-jch)

收稿日期：2015-12-04