紫薯杏鮑菇復合果醋混菌發酵工藝

王陶，李文，董玉瑋，張傳麗，李同祥

(徐州工程學院，江蘇省食品資源開發與質量安全重點建設實驗室，江蘇 徐州，221008)

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紫薯杏鮑菇復合果醋混菌發酵工藝

王陶，李文*，董玉瑋，張傳麗，李同祥

(徐州工程學院，江蘇省食品資源開發與質量安全重點建設實驗室，江蘇 徐州，221008)

摘要以紫薯和杏鮑菇為主要原材料，通過果酒酵母和醋化醋桿菌混合發酵生產復合果醋，采用單因素試驗，正交試驗的方法，優化紫薯和杏鮑菇復合果醋混菌發酵的制備工藝。優化得到的配方及制備工藝條件為：紫薯與杏鮑菇比例為2∶1，白砂糖添加量為15%，pH為4.0，果酒酵母接種量為2.5%，醋化醋桿菌接種量為12%，種齡20 h，接種間隔0 h，裝液量40 mL/250 mL，32 ℃，在此條件下產酸在第7天達到最大，為43.20 g/L，釀制出的紫薯杏鮑菇復合果醋澄清現粉紅色，醋味濃郁，營養豐富，具有紫薯和杏鮑菇清香味。

關鍵詞紫薯；杏鮑菇；混菌發酵；復合果醋；正交試驗

紫薯，又稱黑薯，其肉色介于紫色和深紫色之間。它比一般紅薯的營養價值高，還富含對人體非常重要的硒元素和花青素，以及對人體有益的其他營養物質[1-6]。紫薯本身含有大量對人體有益的營養素，還具有很好的保健功能[5-6]。

杏鮑菇，又稱刺芹側耳或刺芹菇，肉質肥大厚實，口感香脆嫩滑，是人們餐桌上的美味佳肴[7]。人們食用杏鮑菇不僅可以增強人體免疫力，還可以起到預防疾病、抗癌、潤滑腸道、養胃等作用，適量食用對人體健康大有裨益[8-10]。

食醋不僅是人們生活中重要的酸性調味品，它還具有增進食欲、抗癌、軟化血管、降血壓、延緩衰老等多種保健功效[11-12]。相比單一的果醋，復合果醋含有更為全面的營養元素，而且營養物質之間可以更加平衡、合理的相互搭配。所以，復合果醋的產品和研究會成為一個新的熱點，市場前景將更加廣闊[13]?；炀l酵又稱混合發酵，指通過兩種或多種微生物的共生作用或者營養作用聯合完成某種發酵過程的一種新型發酵技術，是純種發酵技術上的新發展[14]。傳統發酵調味品雖然采用單一的菌種純培養發酵，可以縮短生產周期，提高生產效率，但產品的風味欠佳。因此，多菌種混合發酵是生產傳統調味品的根本因素，同時混菌發酵還可以促進新型發酵食品的開發。

本文以紫薯和杏鮑菇為原料，并以實驗室篩選得到的高產果酒酵母和醋化醋桿菌為研究對象，通過單因素試驗、正交試驗對其培養條件進行優化，研究混菌發酵過程中的發酵規律及條件。

1材料與方法

1.1原料

1.1.1材料與試劑

醋化醋桿菌(Acetobacteraceti)，庫德里阿茲威氏畢赤果酒酵母(Pichiakudriavzevii)，徐州工程學院微生物遺傳育種實驗室保存；紫薯、杏鮑菇采購于徐州超市；α-淀粉酶(分析純)，上海源葉生物科技有限公司；果膠酶(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；糖化酶(分析純)，上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2培養基

(1)果酒酵母YPD活化培養基：酵母浸膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，補充蒸餾水到1 000 mL。

(2)果酒酵母種子培養基：麥芽汁100 mL，pH 自然，滅菌 1.05 kg/cm2，20 min。

(3)醋化醋桿菌活化培養基：酵母膏10 g/L，葡萄糖10 g/L，pH4.5，瓊脂粉20 g/L，CaCO310 g/L，121 ℃滅菌20 min后，加入3%(v/v)食用無水酒精。

(4)醋化醋桿菌種子培養基：葡萄糖10 g/L，酵母膏10 g/L，pH4.5，121 ℃滅菌20 min后，加入3%(v/v)食用無水酒精。

1.1.3主要儀器設備

HYG-Ⅱ回旋式恒溫調速搖瓶柜，上海欣蕊自動化設備有限公司；HH.B11.600-S-Ⅱ型電熱恒溫培養箱，上海躍進醫療器械廠；旋轉蒸發儀，瑞士BUCHI 公司。

1.2工藝過程

1.3實驗方法

1.3.1原材料的選擇和預處理

選擇優質的紫薯和杏鮑菇，洗凈后先切成塊狀放入1%的檸檬酸溶液中浸泡4～6 min，進行護色；將經過護色的紫薯塊和杏鮑菇繼續切成片狀，放入90～100 ℃的熱水中漂燙4～6 min，撈出冷卻，分別放入打漿機中粉碎成泥狀，得紫薯泥和杏鮑菇泥，備用。

1.3.2紫薯、杏鮑菇發酵液的獲取

取20 g紫薯泥于小燒杯中，加入100 mL蒸餾水潤洗到250 mL的錐形瓶中制備發酵液，加入0.14%(v/v)淀粉酶、果膠酶，淀粉酶與果膠酶的體積比為1∶2，置于55 ℃的水浴鍋中，酶解40 min。再加入10 g杏鮑菇泥，50 mL蒸餾水，加入0.12%(v/v)果膠酶，置于40 ℃的水浴鍋中，酶解40 min。最后加入0.12%(v/v)糖化酶，置于60 ℃的水浴鍋中，酶解60 min。酶解結束后，進行抽濾，殘渣丟棄，取上清液，備用。

1.3.3果酒酵母種子液的制備

將P.kudriavzevii在YPD培養基(酵母浸膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%)進行活化，活化培養基裝液量為150 mL/250 mL，放于液體培養基中，30 ℃，120 r/min培養24 h，控制菌數在107個/mL，得果酒酵母一級培養液；按照3%的接種量將一級培養液加入到麥芽汁培養基中，30 ℃，120 r/min培養24 h，控制菌數在107個/mL左右，即得果酒酵母種子液。

1.3.4醋化醋桿菌種子液的制備

將醋化醋桿菌在斜面培養基中先活化，32 ℃恒溫培養24 h，取2環斜面醋化醋桿菌，接入種子培養基，培養基裝液量為100 mL/250 mL，恒溫振蕩器中培養，轉速120 r/min，在32 ℃下培養20 h，制得醋化醋桿菌種子液。

1.3.5發酵培養

按果酒酵母種子液1.5%，醋化醋桿菌種子液10%的比例接種到裝有50 mL發酵液的250 mL錐形瓶中，每個處理做3個平行實驗，然后放入恒溫振蕩器，在120 r/min，32 ℃下培養7～8 d。

1.3.6產酸量的計算

根據滴定所耗的NaOH溶液的體積來計算樣品中的含酸量(以醋酸計，g/L) 見公式(1)：

(1)

式中：V，發酵液樣品滴定耗用的NaOH體積，mL；V1，以空白培養基為對照滴定耗用的NaOH體積mL；c[NaOH]，滴定中所用的NaOH濃度，mol/L；K，醋酸換算系數，K=60；V樣，樣品體積，mL。

1.3.7混菌發酵單因素試驗

紫薯杏鮑菇混菌發酵的基礎條件為：白砂糖添加量為15%，pH為4.0，果酒酵母種子液接種量為1.5%，醋化醋桿菌接種量為10%，接種間隔8 h，醋化醋桿菌種齡24 h，酵母菌種齡為24 h，裝液量50 mL/250 mL，120 r/min，32 ℃，發酵周期7～8 d。

1.3.7.1蔗糖添加量對醋酸產量的影響

考察蔗糖添加量分別為5%，10%，15%，20%，25%對復合果醋產酸的影響，在常規條件下測定總酸(以醋酸計)產量。

1.3.7.2初始pH對產酸的影響

考察初始pH分別為3.5，4.0，4.5，5.0，5.5對產酸的影響。

1.3.7.3果酒酵母接種量的優化

考察果酒酵母接種量分別為0.5%，1%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%對復合果醋產酸的影響。

1.3.7.4醋化醋桿菌接種量對產酸的影響

考察醋化醋桿菌接種量分別為6%，8%，10%，12%，14%對復合果醋產酸的影響。

1.3.7.5醋化醋桿菌種齡對產酸的影響

配制紫薯和杏鮑菇復合發酵液，考察醋化醋桿菌種齡梯度為16，20，24，28，32 h對產酸的影響。

1.3.7.6接種間隔對產酸的影響

考察果酒酵母和醋化醋桿菌接種間隔梯度為0，8，16，24，32，40 h對產酸的影響。

1.3.7.7發酵液裝瓶量對產酸的影響

考察裝液量梯度為30，40 ，50，60，70 mL(250 mL瓶)對產酸的影響。

1.3.8混菌發酵的正交優化

在單因素試驗的基礎上，結合實際，通過正交試驗進一步考察裝液量、醋化醋桿菌接種量、種齡和果酒酵母接種量之間的相互影響，并確定紫薯杏鮑菇混菌發酵的最佳工藝參數。

2結果與討論

2.1混菌發酵的單因素優化

2.1.1蔗糖添加量的優化

培養基中加入不同量的蔗糖培養8 d，從第3天起測定每天產酸量，結果如圖1所示。

圖1　蔗糖添加量對產酸量的影響Fig.1　Effect of volume of sugar on acetic acid production

綜合考慮，選擇培養周期為7 d,蔗糖添加量為15%。

2.1.2pH值的優化

以不同pH的培養基加入菌液培養7 d，測定第7天產酸量，如圖2所示。

圖2　pH值對產酸的影響Fig.2　Effects of pH on acetic acid production

從圖2可以看出，pH大于4時，隨著pH增大，產酸量逐漸降低直至平穩，pH為4時，產酸量最大，達到39.30 g/L，可見pH等于4時，為混菌發酵的菌株營造了適宜的生長環境。所以pH為4時條件最優。

2.1.3果酒酵母接種量的優化

在培養基中接種不同含量的果酒酵母培養7 d，測定第7天產酸量，結果見圖3。

圖3　果酒酵母接種量對產酸的影響Fig.3　Effects of inoculation quantity of wine yeast on acetic acid prodution

從圖3可以看出，酵母菌接種量為2.0%時菌體相互作用最好，產酸能達到34.50 g/L，果酒酵母接種量偏少不能給發酵過程提供足夠的酵母菌需要，酵母菌接種量只有0.5%即250 μL時，產酸量只有23.10 g/L，而果酒酵母接種量過大時很有可能會抑制發酵過程的產酸。所以果酒酵母接種量2.0%為最優條件。同時，果酒酵母接種量為2.5%時菌液最渾濁，接種量為1.0%時生物量最低，說明果酒酵母接種量對菌體的生長具有較大影響關系。

2.1.4醋化醋桿菌接種量對產酸的影響

培養基中接入不同含量的醋化醋桿菌培養7 d，測定第7天產酸量，結果見圖4。

圖4　醋化醋桿菌接種量對產酸的影響Fig.4　Effects of inoculation quantity of acetobacter aceti on acetic acid prodution

從圖4可以看出，隨著醋化醋桿菌濃度的增加，產酸量也逐漸增加，當醋化醋桿菌接種量為12%時產酸量達到最大值，為42.60 g/L。醋化醋桿菌濃度繼續增加則會抑制醋化醋桿菌活性，使產酸量降低。醋化醋桿菌接種量為14%時，產酸量只有30.60 g/L。所以選擇12%為醋化醋桿菌最佳接種量。

2.1.5醋化醋桿菌種齡的優化

以每隔4 h的醋化醋桿菌種子培養液為一間隔水平加入發酵液中培養7天，測定第七天產酸量，結果見圖5。

圖5　醋化醋桿菌種齡對產酸的影響Fig.5　Effects of seed age of acetobacter aceti on acetic acid prodution

從圖5可以看出，醋化醋桿菌種齡16 h，菌株活力較低，產酸量較低，只有21.60 g/L。種齡為20 h時，產酸量達到最高，達到38.90 g/L。隨著種子液培養的時間延長，菌株的活性受到的影響也就越大，當種齡為32 h時，產酸只有31.80 g/L。所以種齡為20 h為最佳條件。

2.1.6混菌發酵接種間隔的優化

先接入酵母菌，再以接入酵母菌開始計時起每8 h為一時間跨度依次接入醋化醋桿菌種子液培養7 d，測定第7天產酸量，結果見圖6。

圖6　接種間隔對產酸的影響Fig.6　Effects of inoculation interval on acetic acid prodution

從圖6可以看出，時間間隔為0 h也就是果酒酵母和醋化醋桿菌加入發酵液的時間間隔是0 h，產酸量達到了36.50 g/L。時間間隔為8 h時產酸量達到了31.60 g/L，此后隨著時間間隔的增加，產酸量逐步降低，當間隔為32 h時，產酸量只有5.25 g/L，當間隔為40 h時，產酸量只有3.20 g/L，逐漸趨于0 g/L。說明時間間隔跨度越大產酸越低，可能是酒精發酵過盛，有機物利用的過多，導致醋化醋桿菌菌株活力降低，所以間隔0 h為最優條件，加入酵母菌后，立即進行醋化醋桿菌種子液的接種。

2.1.7裝液量對產酸的影響

根據圖7可以看出，裝液量在50 mL(250 mL的發酵瓶)時，產酸量達到峰值，39.30 g/L。當裝液量高于50 mL時，產酸量漸漸降低，可以看出發酵液占據發酵空間的大小對產酸量的影響很大，可能由于醋酸發酵時需要大量的氧氣，而發酵液量過多則影響到氧氣供給。裝液量在50 mL時，發酵液渾濁程度較大，說明菌體繁殖很快，環境適合菌體生長。

圖7　裝液量對產酸量的影響Fig.7　Effects of liquid volume on acetic acid prodution

2.2正交試驗確定混菌發酵最佳條件

結合單因素試驗結果，選擇裝液量、醋化醋桿菌接種量、種齡和果酒酵母接種量為影響因素，選用L9(34)正交表進行試驗，確定最佳組合，因素水平表如表1所示，正交試驗結果如表2所示。

表1　正交試驗因素水平表

表2　正交試驗結果

由表2可知，各因素對醋酸產量的影響順序為A>B>C>D，即裝液量>醋化醋桿菌接種量>種齡>果酒酵母接種量。其最優方案為A1B1C2D3，即裝液量40 mL，醋化醋桿菌接種量10%、種齡20 h、酵母菌接種量2.5%。由于最佳組合不在實驗設計中，需做驗證實驗。

按照正交實驗優選工藝A1B1C2D3和實驗設計中的最優組合A1B2C2D3平行3次，進行驗證，A1B2C2D3工藝的醋酸產品平均達43.20 g/L，而A1B1C2D3工藝39.90 g/L。通過差異顯著分析，T=4.554>t0.05/2(4)=2.776，表明在α=0.05水平兩種發酵工藝有顯著性差異，因此，正交最優組合A1B2C2D3為較優工藝。

2.3紫薯杏鮑菇復合保健果醋飲料的調配

經過試驗處理，以發酵所得到的紫薯杏鮑菇果醋為基本原料，在經過澄清處理和調配試驗后，確定最佳工藝參數為：加入黃原膠0.25 g/L、紫薯杏鮑菇酶解液45%(v/v)、蔗糖60 g/L和蜂蜜36 g/L。經調配，獲得的紫薯杏鮑菇復合果醋飲料醋酸含量約為4.8%，此時的紫薯杏鮑菇復合果醋產品整體呈粉紅色，色澤美觀，組織比較細膩，澄清、透明，無明顯懸浮物，無肉眼可見外來雜質，酸味純正而柔和，口味綿醇，微甜而不澀，清冽爽口?？偹?以乙酸計)g/100 mL≥2.5，衛生指標符合GB2719的規定。

3結論

利用營養豐富、色澤鮮艷的紫薯和具有藥食功效的杏鮑菇進行復配，從而使最終發酵果醋產品營養豐富，色澤美觀，兼具紫薯和杏鮑菇的營養保健功效，在發酵過程中，充分利用果酒酵母和醋化醋桿菌混菌發酵的優勢，優化了混菌發酵過程中的關鍵因素，果酒酵母接種量、醋化醋桿菌接種量、接種間隔、裝液量、果酒酵母種齡、醋化醋桿菌種齡，確定了最佳混菌發酵工藝條件，蔗糖添加量為15%，pH為4.0，果酒酵母種子液接種量為2.5%，醋化醋桿菌接種量為12%，接種間隔0 h，醋化醋桿菌種齡20 h，酵母菌種齡為24 h，裝液量40 mL/250 mL，120 r/min，32 ℃，在最佳發酵工藝條件下，復合果醋中醋酸含量達到43.20 g/L。

混菌發酵工藝集中了酵母菌，醋化醋桿菌混菌發酵的優點，能縮短酒精發酵和醋酸發酵周期，制得的紫薯杏鮑菇復合果醋營養豐富，色香味俱全，果香濃郁，色澤誘人，口感醇厚，醋酸的產量高，保證產品質量，簡單、成本經濟，具有廣闊的推廣應用前景。

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Mixed fermentation of compound fruit vinegar of Purple sweet potato andPleurotuseryngii

WANG Tao, LI Wen*, DONG Yu-wei, ZHANG Chuan-li, LI Tong-xiang

(Jiangsu Key Construction Laboratory of Food Resource Development and Quality Safe(Xuzhou Institute of Technology),Xuzhou 221008, China)

ABSTRACTPurple sweet potato andpleurotus eryngii were selected as main raw materials to make fermented Purple sweet potato-pleurotus eryngii compound fruit Vinegar through mixed fermentation of wine yeast and acetobacter aceti. The process and formula of Purple sweet potato-pleurotus eryngii compound fruit Vinegar were optimized through single-factor and orthogonal tests. Experimental results showed that the optimal formula and preparation process conditions were as follows: the mass ratio of purple sweet potato to Pleurotus eryngii was 2∶1, white suger degree of 15%, initial pH 4.0, wine yeast inoculation quantity of 2.5%, acetobacter aceti inoculation amount of 12%, seed age 20 h, inoculation interval 0 h, fluid volume 40 mL/250mL, fermentation temperature of 32 ℃. Acetic acid concentration could reach 43.20 g/L based on optimal technological conditions and fermentation period of 7 days. The final pink product of Purple sweet potato-Pleurotus eryngii compound fruit vinegar with strong vinegar smell was purified, and it had good nutrition and all distinctive characteristics of Purple sweet potato and Pleurotus eryngii.

Key wordsPurple potato; Pleurotus eryngii; mixed fermentation; compound fruit vinegar; orthogonal experiment

收稿日期：2015-08-09，改回日期：2015-10-16

基金項目：國家自然科學基金(81273004，31270577)；江蘇省青藍工程項目；江蘇省高校自然科學研究面上項目(15KJD550002)；徐州市科技計劃項目(XF13C034)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602017

第一作者：博士，副教授(李文為通訊作者)。