藤椒水提液的體外抗氧化能力

徐林，蒲彪，蔣燕，譚欣婷，王雙，王春霞，張玲，孫澎悅

(四川農業大學 食品學院，四川 雅安，625014)

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藤椒水提液的體外抗氧化能力

徐林，蒲彪*，蔣燕，譚欣婷，王雙，王春霞，張玲，孫澎悅

(四川農業大學 食品學院，四川 雅安，625014)

摘要為了研究藤椒水提液的體外抗氧化能力，以二丁基羥基甲苯(BHT)做陽性對照，以多酚含量，還原力和羥自由基(·OH)、DPPH自由基清除率為評價指標研究其體外抗氧化活性。結果表明：藤椒水提液中多酚含量較為豐富，每1 mL含有多酚2.442 mg。水提液的還原能力、自由基清除率均隨其質量濃度的增加而增強，具有一定的抗氧化活性。4 mg/mL的藤椒水提液與0.1 mg/mL的BHT的還原力基本相當，藤椒水提液對·OH、DPPH自由基的IC(50)值分別為7.65和7.94 mg/mL，20 mg/mL的藤椒水提液的·OH自由基清除率為61.25%，高于1 mg/mL BHT的56.16%，10 mg/mL的藤椒水提液的DPPH自由基清除率為55.01%，而1 mg/mL的BHT的清除率為45.03%。

關鍵詞藤椒水提液；抗氧化能力；BHT；還原力；自由基

藤椒，學名竹葉花椒(ZanthoxylumarmatumDC. Prodr.)，屬于蕓香科花椒屬花椒亞屬，是我國花椒種質資源中的一個優良品種，其風味芳香而麻味略淡，果油多[1]。生長于金沙江流域和大渡河上游，四川洪雅縣是全國規模最大的藤椒種植基地[2-3]。

本屬植物的主要化學成分有揮發油、黃酮、生物堿、多酚、酰胺類物質和香豆素等[4]，是一種藥食同源的植物，不僅可作為調味品，還具有降壓、鎮痛、抑菌殺蟲、抗氧化的功效[5]。藤椒主要用于制作“藤椒油”，四川洪雅藤椒油作為調味料已形成獨特的“藤椒菜品”系列。但是，藤椒一直以來被認為是花椒的野生品種，關于藤椒的成分、生物活性等的研究報道較少，而現有的研究多是以藤椒油為對象，關于藤椒的研究有待進一步的探索完善。

花椒作為一種中草藥，在《本草綱目》和《中國藥典》中均有記載，并為世人所知。此外，中草藥多是以水煎劑的形式使用的，那么水提液中的活性成分的研究，將有利于在醫藥方面的進一步應用。本研究中以抗氧化活性為檢測指標，采用水蒸氣蒸餾法分離藤椒水提液和揮發油，以藤椒水提液為材料，分析了藤椒水提液的還原力及羥自由基、DPPH自由基清除率的效果。

1材料與方法

1.1材料與試劑

鮮藤椒(2014年7月于四川洪雅采集)，由四川洪雅縣幺麻子食品有限公司提供。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)標準品，美國Sigma公司；二丁基羥基甲苯(BHT)、K3Fe(CN)6、三氯乙酸、FeCl3、無水乙醇、 TriS(三羥甲基氨基甲烷)、H2O2、FeSO4·7H2O、水楊酸等，均為國產分析純。

1.2主要儀器設備

HH-2數顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司； FW-400A萬能粉碎機，北京中興偉業儀器有限公司；UV-3100紫外可見分光光度計，上海美普達儀器有限公司；CP225D型電子天平，德國賽多利斯股份公司，500WHHS-25電子恒溫不銹鋼水浴鍋，上海光地儀器設備有限公司等。

1.3實驗方法

1.3.1藤椒水提液的制備

按照GB/T 17527—2009，取一定量鮮藤椒除去雜物，于冷凍干燥機下干燥，然后粉碎過20目篩子。稱取藤椒粉末20 g，加水200 mL，連接揮發油提取裝置，沸水浴4 h，得到藤椒揮發油和藤椒水提液。將藤椒水提液抽濾除去廢渣，并在6 000 r/min、4 ℃下離心10 min，進一步除去雜質，備用。

1.3.2多酚含量的測定

1.3.2.1標曲的測定

按照福林酚法測藤椒水提液的多酚含量[6-7]，配制1 mg/mL的沒食子酸標準儲備溶液，分別吸取1.0 、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的沒食子酸標準儲備液于100 mL容量瓶中，用水定容到刻度，搖勻，標記為10、20、30、40、50 μg/mL的沒食子酸工作液。

1 mL沒食子酸工作液，加入5 mL的福林酚試劑，搖勻，反應5 min，加入4.0 mL的質量分數7.5%的Na2CO3溶液，室溫反應60 min。在765 nm下測吸光值。

1.3.2.2樣品溶液的制備及多酚含量的計算

藤椒水溶液稀釋50倍、60倍、70倍、80倍。計算出相應的濃度，按照標曲的測定步驟，在765 nm下測吸光值。用蒸餾水代替樣品做空白。根據標曲計算多酚的含量。

1.3.3還原力的測定

采用鐵離子還原能力測定法測其還原力[8-9]。分別取2 mL不同濃度的樣品溶液于試管中，依次加入2.5 mL 0.2 mo1/L pH 6.6的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、2.5 mL質量分數1% K3Fe(CN)6溶液，充分混合并搖勻，于50 ℃水浴中反應20 min，快速冷卻加入2.0 mL體積分數10%三氯乙酸終止反應，并以3 000 r/min離心10 min，取離心樣液的上清液2.5 mL，再加2.5 mL蒸餾水和0.5 mL質量分數0.1% FeCl3，充分混勻，在室內靜置10 min后在700 nm處測吸光值A。以空白試劑作為陰性對照，以BHT溶液為陽性對照，重復3次，取平均值。

1.3.4羥自由基清除率的測定

分別加入2.0 mL 9 mmol/L FeSO4溶液，加入不同濃度的花椒水提液2.0 mL，再加1.0 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液 ，搖勻，靜置10 min，再加入9 mmol/L的水楊酸溶液2.0 mL，搖勻，37 ℃恒溫水浴鍋中反應30 min后，于波長510 nm處測吸光度A[10]，空白試劑代替水楊酸為對照組，空白試劑代替樣品為空白組，以BHT作為陽性對照，每個樣品重復3次，取平均值。

式中：I表示清除率%；A1為樣品組吸光值；A0為樣品本底吸光值；A空為空白對照組吸光值。

1.3.5清除DPPH自由基的能力

取0.5 mL不同濃度的藤椒水提液，分別加入2.0 mL(0.2 mmol/L )DPPH-乙醇溶液，混勻，避光反應30 min，以體積分數95%乙醇調零，于波長517 nm處測定吸光度[11-12]。對照組用2.0 mL 95%乙醇代替DPPH溶液，空白組為2.0 mL DPPH溶液與2.0 mL 95%乙醇混合，以BHT為陽性對照，每個樣品重復3次，取平均值。按以下公式計算DPPH·清除率。

式中：I表示清除率/%；A1為樣品組吸光度；A0為對照組吸光度；A空為空白組吸光度。

2結果與分析

2.1藤椒水提液的多酚含量

花椒中多酚含量比較豐富，有研究表明：花椒提取物具有較強的的自由基清除能力，可能與多酚類物質等有關[13]。

藤椒水提液中多酚含量的標曲如圖1所示，以沒食子酸為標準品繪制標準曲線，得到標準曲線方程為：Y=0.011 2x-0.028，R2=0.999 4。結合標曲計算出藤椒水提液中每1 mL含有多酚2.442 mg。

圖1　福林酚法測定沒食子酸標準曲線Fig.1　Folin - phenol method for the determination of gallic acid standard curve

2.2藤椒水提液的還原力

一般來說，物質的還原能力與抗氧化活性之間存在顯著的相關性，還原力強，就表示其具有強的抗氧化性，在Fe3+-Fe2+氧化還原體系中，會有顏色變化，并且在700 nm處有較大吸光峰，因此，可通過顯色反應來判斷還原程度，吸光度越大，表示其還原能力越強，抗氧化能力也越強[14]。

圖2　BHT與藤椒水提液的還原力Fig.2　Reducing power of BHT and water extract fromZanthoxylum armatum DC. Prodr.

由圖2可知，在一定濃度內，BHT和藤椒水提液的還原力都隨濃度的增大而增大，但是藤椒水提液的還原力要弱于BHT的還原力。4 mg/mL的藤椒水提液與0.1 mg/mL的BHT的還原力基本相當。藤椒水提液還是具有一定的抗氧化活性。

2.3藤椒水提液清除羥自由基的能力

·OH是造成組織細胞損傷的重要活性氧之一。人體在正常的生命活動中通過新陳代謝即可以產生·OH，它可以引起膜過氧化、蛋白質交聯變性、核酸損傷等，是公認的毒性最大的自由基[15]。

在反應體系中，H2O2和Fe2+混合發生Fenton反應，產生大量高反應活性的羥自由基，當其被水楊酸捕捉時，會產生有色物質，并在510 nm處有最大的吸收峰。若樣液中具有清除羥自由基作用的物質存在時，便會與水楊酸發生競爭，從而使有色產物生成量減少，吸光度降低[16]。

由圖3可知，BHT和藤椒水提液對·OH都有較好的清除效果，且清除作用隨質量濃度的增加而逐漸增強，呈較明顯的劑量效應關系。藤椒水提液和BHT的IC50值分別為7.65 mg/mL和0.94 mg/mL，當藤椒水提液濃度達到20 mg/mL時，清除率為61.25%，要高于1 mg/mL的BHT的清除率(56.16%)。

圖3　BHT與藤椒水提液對羥自由基的清除作用Fig. 3　Scavenging activity against hydroxyl free radicals of BHT and water extract from Zanthoxylum armatum DC． Prodr.

2.4藤椒水提液清除DPPH·的能力

DPPH·是一種穩定的自由基，通常被作為評價產物是否具有抗氧化活性的指標。其結構中含有1個孤對電子，在乙醇溶液中呈不同程度的紫羅蘭色，在517 nm附近有較強的吸收峰，自由基清除劑能與孤對電子配對反應，使溶液顏色發生變化，由紫色變化為黃色，同時在517 nm處的吸光度也隨之變小，而吸光度變小的程度則反應著自由基被清除的程度，兩者具有一定的相關性[17]。

由圖4可知，藤椒水提液對DPPH自由基的清除效果較好，當水提液濃度達到10 mg/mL以后，清除率比較穩定，隨濃度的增大變化較小。藤椒水提液和BHT的IC50值分別為7.94 mg/mL和1.12 mg/mL，同時當藤椒水提液的濃度為10 mg/mL時，DPPH自由基的清除率為55.01%，清除效果要好于1 mg/mL的BHT(45.03%)。

圖4　BHT與藤椒水提液對DPPH自由基的清除作用Fig. 4　Scavenging activity against DPPH free radicals ofBHT and Water extract from Zanthoxylum armatum DC． Prodr.

3結論

通過水蒸氣蒸餾法得到藤椒水提液，采用體外抗氧化模型，以BHT為陽性對照，以多酚含量、還原力、羥基自由基清除率和DPPH自由基清除率為指標，評價分析藤椒水提液的體外抗氧化活性。結果表明，藤椒水提液的抗氧化能力與BHT對比，相對差一些，但是仍具有一定的抗氧化活性，其抗氧化活性與樣品具有較好的劑量-效應依賴關系。藤椒水提液中每1mL含有多酚的量為2.442 mg。4 mg/mL的藤椒水提液與0.1 mg/mL的BHT的還原力基本相當。藤椒水提液對羥基自由基和DPPH自由基清除率的IC50分別為7.65 mg/mL和7.94 mg/mL，BHT對羥基自由基和DPPH自由基清除率的IC50的IC50值分別為0.94 mg/mL和1.12 mg/mL，同時20 mg/mL的藤椒水提液的羥基自由基清除率為61.25%，高于1 mg/mL的BHT的清除率(56.16%)。藤椒水提液的濃度為10 mg/mL時，DPPH自由基的清除率為55.01%，清除效果好于1 mg/mL的BHT的清除率(45.03%)。

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Studies on the antioxidatant activities of water extract fromZanthoxylumarmatumDC. Prodr.invitro

XU Lin, PU Biao*, JIANG Yan, TAN Xin-ting, WANG Shuang,WANG Chun-xia, ZHANG Ling, SUN Peng-yue

(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

ABSTRACTTo investigate in vitro antioxidant activities of water extract from Zanthoxylum armatum DC. Prodr., BHT was used as a positive control, polyphenol content, reducing power， hydroxyl radical rate and DPPH radical scavenging ability were used to evaluate antioxidant activity. The results showed that the water extract from Zanthoxylum armatum DC. Prodr. is rich in polyphenol content of 2.442 mg/ ml. The reducing power, hydroxyl free radicals, DPPH radicals, scavenging capacity increased gradually with the increasing of the mass concentration. The reducing power of 4 mg/mL water extract was equal to 0.l mg/mL BHT. The extract IC(50) of hydroxyl radical and DPPH scavenging rate was 7.65 mg/mL and 7.94 mg/mL, respectively.The scavenging rates of 2 0 mg/mL water extract on hydroxyl radicas was 61.25%，which was much better than l mg/mL BHT. The scavenging rates of l0 mg/mL water extract on DPPH radicals was 55.01%，while the scavenging rates of l mg/mL BHT was 45.01%。

Key wordswater extract from Zanthoxylum armatum DC. Prodr.;antioxidatant activities;BHT;reducing power;free radicals

收稿日期：2015-08-16，改回日期：2015-09-17

基金項目：國家自然科學基金[基于微生態的傳統四川泡菜風味品質形成機理(31171726)]；社會公益研究專項計劃四川花椒良種選育及高效優質栽培技研究(201304703)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602025

第一作者：碩士研究生(蒲彪教授為通訊作者,E-mail:pubiao2002@163.com)。